Laporan Mikrobiologi 2

LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

MODUL II

STERILISASI, PEMBUATAN MEDIA, DAN PEWARNAAN

Disusun Oleh

Riana Mentarijuita

26020110110042

Kelompok 1

Asisten

Mukti Kusumaningrum Diana Putri

K2D008056

PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN

JURUSAN ILMU KELAUTAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG

2011

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Bakteri ada dimana-mana. Dalam tanah, air dan udara. Bahkan dalam perut hewan dan manusia, di sumber air panas dan di lapisan es yang amat dingin. Definisi mikroba adalah sebagai ilmu yang mempelajari tentang organisme mikroskopis. Mikrobiologi berasal dari bahasa Yunani, mikros = kecil, bios = hidup dan logos = ilmu. Ilmuwan menyimpulkan bahwa mikroorganisme sudah dikenal lebih kurang 4 juta tahun yang lalu dari senyawa organik kompleks yang terdapat di laut, atau mungkin dari gumpalan awan yang sangat besar yang mengelilingi bumi. Sebagai makhluk hidup pertama di bumi, mikroorganisme diduga merupakan nenek moyang dari semua makhluk hidup

 Mikrobiologi adalah sebuah cabang dari ilmu biologi yang mempelajari mikroorganisme. Objek kajiannya biasanya adalah semua makhluk (hidup) yang perlu dilihat dengan mikroskop, khususnya bakteri, fungi, alga mikroskopik, protozoa, dan Archaea. Virus sering juga dimasukkan walaupun sebenarnya tidak sepenuhnya dapat dianggap sebagai makhluk hidup (Jutono, 1972).

Mikrobiologi dimulai sejak ditemukannya mikroskop dan menjadi bidang yang sangat penting dalam biologi  pada zaman Loius Pasteur. Perkembangan biologi yang pesat pada abad ke-19 terutama dialami pada bidang ini dan memberikan landasan bagi terbukanya bidang penting lain: biokimia. Awal abad 20 ahli mikrobiologi telah meneliti bahwa mikroorganisme mampu menyebabkan berbagai macam perubahan kimia baik melalui penguraian maupun sintesis senyawa organik yang baru.

Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium sebaiknya menggunakan air suling. Air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat (Hadioetomo, 1993).

Peran mikroba yang menguntungkan, antara lain dalam hal membantu metabolisme, sebagai bahan pakan atau pakan tambahan, dan probiotik. Dalam hal metabolisme, mikroba mampu menghidrolisis selulosa, karena enzim selulosa yang dimilikinya. Selain itu bakteri mampu menggunakan urea sebagai sumber N. Dalam penyediaan bahan pakan/pakan tambahan, terdapat jenis mikroba yang sangat potensial.

Salah satu bagian yang penting dalam mikrobiologi adalah pengetahuan tentang cara-cara mematikan, menyingkirkan, dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Cara yang digunakan untuk menghancurkan, menghambat pertumbuhan mikroorganisme dan menyingkirkan mikroorganisme berbeda-beda tergantung spesies yang dihadapi. Selain itu lingkungan dan tempat mikroba ini pun berbeda-beda misalnya dalam darah, makanan, air, sampah, roil, dan tanah. Hal tersebut juga dapat dijadikan sebagai bahan pertimbangan untuk menentukan cara untuk menghancurkan mikroorganisme yang digunakan tergantung pada pengetahuan, keterampilan dan tujuan dari yang melaksanakannya, sebab tiap situasi yang dihadapi merupakan kenyataan-kenyataan dasar yang dapat menuntun pada cara atau prosedur yang harus dilakukan.

Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas),  penyaringan,  penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993).

Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Subtansi kimia organik dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrien diambil dari likungan kemudian ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler (Lim, 1998). Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk dinding sel baru (Volk, 1993).

Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-40^oC (Volk, 1993).

Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Berikut ini beberapa media yang sering digunakan secara umum dalam mikrobiologi.

Pada Praktisnya, semua media tersebut secara komersial dalam bentuk bubuk, seperti PCA(Plate Count Agar), NA(Nutrient Agar), TSA (Trypticase Soy Agar) dan lain-lain.

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Tryana, 2008).

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengamati hal tersebut maka dikembangkansuatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitisn mikrobiologi (Rizki, 2008).

Sehingga dapat disimpulkan bahwa praktikum mikrobiologi mengenai sterilisasi, pembuatan media, serta pengecatan sangatlah diperlukan. Karena dengan mengetahui serta memahaminya. Praktikan akan menguasainya dan dapat mengaplikasikannya dalam kehidupan sehari-hari. Sehingga ilmu mikrobiologi yang benar dapat diterapkan dalam dunia kelautan.

1.2  Tujuan

-          Praktikan memahami bermacam-macam teknik sterilisasi.

-          Praktikan dapat mengoperasikan alat-alat sterilisasi.

-          Praktikan memahami mengenai bermacam-macam media.

-          Praktikan dapat membuat media.

-          Praktikan memahami bermacam-macam teknik pewarnaan.

-          Praktikan dapat melakukan gram, acid fast, pewarnaan endospore, dan  pewarnaan flagella.

1.3  Manfaat

-          Mahasiswa menjadi mengetahui lebih mendalam mengenai pentingnya sterilisasi sebagai teknik utama dalam mikrobiologi.

-          Praktikan pun mampu mengaplikasikan teknik sterilisasi dalam kehidupan sehari-hari, apabila ingin melakukan penelitian mengenai Mikroba.

-          Mahasiswa mengerti perbedaan dari media dimana sebagai tempat tumbuh mikroba. Praktikan mengerti tentang pewarnaan pada mikroba, sehingga dapat diaplikasikan langsung.

-          Praktikan pun mengetahui perbedaan dalam pengamatan bakteri dari berbagai penelitian mengenai pewarnaan bakteri itu sendiri.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1  Pengertian Mikrobiologi

Mikrobiologi adalah suatu ilmu yang mempelajari kehidupan makhluk yang bersifat mikroskopik yang disebut mikroorganisme atau jasad renik, yaitu makhluk yang mempunyai ukuran sel sangat kecil dimana setiap selnya hanya dapat dilihat dengan pertolongan mikroskop. Dalam teknologi pangan, mikrobiologi merupakan ilmu yang sangat penting, misalnya dalam hubungannya dengan kerusakan atau kebusukan makanan sehingga dapat diketahui tindakan pencegahan atau pengawetan yang paling tepat untuk menghindari terjadinya kerusakan tersebut. Di samping itu, mikrobiologi juga penting dalam fermentasi makanan, sanitasi, pengawasan mutu pangan, dan sebagainya. Adanya jasad renik di dalam makanan mungkin tidak diinginkan jika jasad renik tersebut dapat menyebabkan kerusakan dan kebusukan makanan, atau menyebabkan keracunan bagi yang mengkonsumsinya. Tetapi dalam fermentasi makanan dan minuman, pertumbuhan jasad renik justru dirangsang untuk mengubah komponen-komponen di dalam bahan pangan tersebut menjadi produk-produk yang diinginkan (Tortora dkk, 2010).

Selain itu, Mikrobiologi adalah merupakan suatu cakupan tentang biologi dimana berkaitan dengan bentuk kehidupan kecil yang tidak dapat di observasi tanpa pembesaran. Mereka seperti bakteri, virus, fungi, protozoa, algae, dan helminthes (Cacing Parasit).

Mikrobiologi juga merupakan satu dari ilmu yang terbesar dan terkompleks mengenai ilmu biologi sendiri. Ini dikarenakan kedisplinan yang tinggi untuk melakukan observasi kepada mikroorganisme. Umumnya mikrobiologi mempelajari aspek-aspek dari mikroba, seperti genetic mereka, fisiologi, karateristik yang mungkin dapat menguntungkan maupun tidak, cara mereka berinteraksi dengan lingkungan, dan cara mereka berinteraksi dengan inang dan pemanfaatan mereka untuk industry dan agriculture.

Bidang-bidang khusus yang berkaitan dengan mikrobiologi, yaitu    :

1.      Geomicrobiologist             : Dimana focus dengan peran mikroba dalam pembentukan earth crust.

2.      Marine microbiologist       : Dimana mempelajari samudera dan organisme laut yang kecil.

3.      Medical technologist         : Dimana mengetes serta membantu mendiagnosa bakteri pathogen dan penyakit yang ditimbulkan.

4.      Astrobiologist                   : Dimana mempelajari kemungkinan organisme di angkasa (Kathleen, Park, 2009).

2.2  Sejarah Mikrobiologi

Antony van Leeuwenhoek (1632–1723) sebenarnya bukan peneliti atau ilmuwan yang profesional. Profesi sebenarnya adalah sebegai wine terster di kota Delf, Belanda. Ia biasa menggunakan kaca pembesar untuk mengamati serat-serat pada kain. Sebenarnya ia bukan orang pertama dalam penggunaan mikroskop, tetapi rasa ingin tahunya yang besar terhadap alam semesta menjadikannya salah seorang penemu mikrobiologi. Leewenhoek menggunakan mikroskopnya yang sangat sederhana untuk mengamati air sungai, air hujan, saliva, feses dan lain sebagainya. Ia tertarik dengan banyaknya benda-benda bergerak tidak terlihat dengan mata biasa. Ia menyebut benda-benda bergerak tadi dengan animalcule

yang menurutnya merupakan hewan-hewan yang sangat kecil. Penemuan ini membuatnya lebih antusias dalam mengamati benda-benda tadi dengan lebih meningkatkan fungsi mikroskopnya. Hal ini dilakukan dengan menumpuk lebih banyak lensa dan memasangnya di lempengan perak. Akhirnya Leewenhoek membuat 250 mikroskop yang mampu memperbesar 200–300 kali. Leewenhoek mencatat dengan teliti hasil pengamatan tersebut dan mengirimkannya ke British Royal Society. Salah satu isi suratnya yang pertama pada tanggal 7 September 1974 ia menggambarkan adanya hewan yang sangat kecil, sekarang dikenal dengan protozoa. Antara tahun 1632–1723 ia menulis lebih dari 300 surat yang melaporkan berbagai hasil pengamatannya. Salah satu diantaranya adalah bentuk batang, kokus maupun spiral yang sekarang dikenal dengan bakteri. Penemuan-penemuan tersebut membuat dunia sadar akan adanya bentuk kehidupan yang sangat kecil dan akhirnya melahirkan ilmu mikrobiologi.

Penemuan Leewenhoek tentang animalcules menjadi perdebatan dari mana asal animalcules tersebut. Ada dua pendapat, satu mengatakan animacules ada karena proses pembusukan tanaman atau hewan, melalui fermentasi misalnya. Pendapat ini mendukung teori yang mengatakan bahwa makhluk hidup berasal dari proses benda mati melalui abiogenesis. Konsep ini dikenal dengan generatio spontanea. Kedua mengatakan bahwa animalcules berasal dari animalcules sebelumnya seperti halnya organismea tingkat tinggi. Pendapat atau teori ini disebut biogenesis. Mikrobiologi tidak berkembang sampai perdebatan tersebut terselesaikan dengan dibuktikannya kebenaran teori biogenesis. Pembuktian ini dilakukan berbagai macam eksperimen yang nampaknya sederhana tetapi memerlukan waktu labih dari 100 tahun (Michael, J. 1988).

2.2.1        Pembuktian Ketidakbenaran dari Abiogenesis

Franscesco Redi (1626–1697) menunjukkan bahwa ulat yang ada dalam daging busuk adalah larva, yang berasal dari telur lalat, bukan hasil dari generatio spontanea.  John Needham (1713–1781) memasak sepotong daging untuk menghilangkan organisme yang ada dan menempatkannya dalam toples yang terbuka. Akhirnya ia mengamati adanya koloni pada permukaan daging tersebut. Ia menyimpulkan bahwa mikroorganisme terjadi spontan dari daging. Lazarro Spalanzani (1729–1799) merebus kaldu daging selama 1 jam dan menempatkannya pada toples yang disegel/ditutup rapat menunjukkan tidak ditemukannya mikroorganisme dalam kaldu tersebut. Jadi eksperimen ini menentang teori abiogenesis. Tetapi Neddham mengatakan bahwa sumber makhluk hidup tadi adalah udara dimana pada percobaan Spalanzani tersebut tidak berinteraksi langsung dengan udara. Hampir 100 tahun setelah percobaan Needham ada 2 peneliti yang mencoba memecahkan kontroversi tentang peran udara. Pada tahun 1836, Franz Schulze melewatkan larutan asam kuat ke dalam tabung tertutup yang berisi daging yang telah dimasak.

 Tahun 1837, Theodor Schwann mengalirkan udara panas melalui pipa ke dalam tabung tertutup yang berisi kaldu. Keduanya tidak menemukan adanya mikroba sebab mikroba telah mati oleh adanya asam kuat maupun oleh panas. Tetapi para pendukung teori generatio spontanea berpendapat bahwa adanya asam dan panas akan mengubah udara sehingga tidak mendukung pertumbuhan mikroba. Sampai akhirnya tahun 1954 peneliti menyelesaikan perdebatan tersebut dengan melakukan percobaan menggunakan tabung tertutup berisi kaldu yang telah dipanaskan. Ke dalam tabung tersebut dimasukkan pipa yang sebagiannya diisi dengan kapas dan ujungnya dibiarkan terbuka. Dengan demikian mikroba akan tersaring dan udara tetap bisa masuk. Dengan tidak ditemukannya mikroba akan tersring dan udara tetap bisa masuk. Dengan tidak ditemukannya mikroba dalam kaldu daging tersebut membuktikan bahwa teori generatio spontanea adalah salah (Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005).

2.2.2        Bukti Teori Biogenesis

Pada perioda yang sama muncul ilmuwan baru dari Fransis Louis Pasteur (1822–1895) seorang ahli kimia yang menaruh perhatian pada mikroorganisme. Oleh karena itu ia tertarik untuk meneliti peran mikroba dalam industri anggur dalam pembuatan alkohol. Salah satu pendukung teori generatio spontanea yang hidup pada masa Louis Pasteur adalah Felix Archimede Pouchet (1800–1872). Pada tahun 1859 ia banyak mempublikasikan tulisan yang mendukung abiogenesis. Tetapi ia tidak dapat membantah penemuan-penemuan Pasteur. Untuk memastikan pendapatnya, Pasteur melakukan serangkaian eksperimen, ia menggunakan bejana dengan leher panjang dan dibengkokkan yang dikenal dengan leher angsa. Bejana ini diisi dengan kaldu kemudian dipanaskan. Udara dapat dengan bebas melewati tabung atau pipa leher angsa tersebut tetapi tidak ditemukan adanya mikroorganisme di kaldu tadi. Dalam hal ini mikroba beserta debu/asap akan mengendap pada bagian tabung yang berbentuk U sehingga tidak dapat mencapai kaldu. Ia juga membawa tabung tersebut ke pegunungan Pyrenes dan Alpen. Pasteur menemukan bahwa mikroorganisme terbawa debu oleh udara dan ia menyimpulkan bahwa semakin bersih/murni udara yang masuk ke dalam bejana, semakin sedikit kontaminasi yang terjadi. Pada tanggal 7 April 1864 ia mengatakan bahwa: For I hape kept them and am still keeping from them, that one thing that is above the power of man to make; i have kept from them, the germ that float in the air, i have kept them from file.

Salah satu argumen klasik untuk menantang biogenesis adalah bahwa panas yang digunakan untuk mensterilkan udara atau bahan juga dianggap merusak vital force. Mereka yang mendukung teori abiogenesis berpendapat bahwa tanpa adanya kekuatan vital force tersebut mikroorganisme tidak dapat muncul serta spontan. Untuk merespon argumen tersebut John Tyndall mengatakan udara dapat dengan mudah dibebaskan dari mikroorganisme dengan cara melakukan pecobaan dengan meletakkan tabung reaksi berisi kaldu steril ke dalam kotak tertutup. Udara dari luar masuk ke dalam kotak melalui pipa yang sudah dibengkokkan membentuk dasar U seperti spiral. Terbukti bahwa meskipun udara luar dapat masuk ke dalam kotak yang berisi tabung dengan kaldu di dalamnya, namun tidak ditemukan adanya mikroba. Hasil percobaan Pasteur dan Tyndall memacu diterimanya konsep biogensis. Selanjutnya Pasteur lebih memfokuskan penelitiannya pada peran mikroba dalam pembuatan anggur dan mikroba yang menyebabkan penyakit (Robinson, R. K. 1990).

2.2.3        Teori Tentang Fermentasi

Fermentasi terjadi jika jur anggur kita biarkan. Melalui serangkaian perubahan biokimia, alkohol dan senyawa lain dihasilkan dari anggur tersebut. Salah satu alasan mengapa Pasteur ingin menentang pendapat generatio spontanea adalah keyakinannya bahwa produk fermentasi anggur merupakan hasil mikroorganisme yang ada, bukan fermentasi menghasilkan mikroorganisme sebagaimana yang dipercaya pada waktu tersebut. Pada tahun 1850. Pasteur memecahkan masalah yang timbul dalam industri anggur. Dengan meneliti anggur yang baik dan anggur yang kurang bagus Pasteur menemukan mikroorganisme yang berbeda.

Mikroorganisme tertentu mendominasi anggur yang bagus sementara tipe mikroorganisme lain mendominasi anggur yang kurang bagus. Dia menyimpulkan bahwa pemilihan mikroorganisme yang sesuai akan menghasilkan produk yang bagus. Untuk itu dia memusnahkan mikroba yang telah ada dalam sari buah anggur dengan cara memanaskannya. Setelah dingin ke dalam sari buah tersebut diinokulasi dengan anggur yang berkualitas baik yang mengandung mikroorganisme yang diinginkan. Hasilnya menunjukkan bahwa anggur yang dihasilkan memiliki kualitas yang baik dan tidak mengalami perubahan aroma

selama disimpan jika sebelumnya dipanasi dulu selama beberapa menit pada 50–60˚ Proses ini dikenal dengan pasteurisasi yang digunakan secara luas di bidang industri makanan. Sebelumnya orang meningkatkan produk fermentasi melalui trial and error dimana sebelumnya tidak tahu bahwa kualitas produk tergantung pada mikroorganisme tertentu (Robinson, R. K. 1990).

2.2.4        Penyebab Infeksi/Penyakit

Disamping membuat revolusi (perubahan besar) dalam bidang industri anggur, Pasteur dan asistennya juga mengemukakan teori baru mengenai penyebab penyakit. Dalam penelitiannya mereka menemukan agen penyebab penyakit serius baik pada hewan maupun manusia. Tetapi sebelum Pasteur telah membuktikan bahwa mikroba merupakan penyebab penyakit, beberapa peneliti membuat argumen yang kuat terhadap teori bakteri penyebab penyakit. Sebelumnya, dalam serajah manusia ada kepercayaan bahwa penyakit itu disebabkan oleh beberapafaktor yang tidak jelas misalnya udara yang jelek, darah yang jelek dan lain-lainnya.

Pada tahun 1546, Girolamo Fracastolo (1483–1553) penyakit dapat disebabkan oleh mikroorganisme, ditularkan dari 1 orang ke orang lain. Sebagian besar informasinya berasal dari percakapannya dengan para pelaut yang baru pulang dari perjalanannya ke luar negeri, dimana mereka menyaksikan penyebaran berbagai penyakit. Lebih dari 200 tahun kemudian Anton von Plenciz (1705–1786) mengatakan bahwa tidak hanya makhluk hidup yang merupakan penyebab penyakit tetapi juga agen yang lain merupakan penyebab penyakit yang berbeda.

Pada saat yang bersamaan konsep tentang makhluk hidup atau bentuk lain yang menggunakan nutrien mulai diterima. Setelah sukses dengan fermentasinya, Pasteur diminta untuk meneliti penyakit ulat sutra yang merugikan industri di Perancis. Dia menghabiskan waktu 6 tahun untuk membuktikan bahwa mikroorganisme yang disebut dengan protozoa dapat menyebabkan penyakit. Pasteur juga menunjukkan kepada petani ulat sutera bagaimana cara menghilangkan penyakit dengan cara memilih ulat sutera yang bebas penyakit untuk diternakkan.

Di Jerman, Robert Koch (1843–1910) seorang profesional di bidang kesehatan mendapat hadiah mikroskop dari isterinya untuk hadiah ulang tahunnya yang ke-28. Selanjutnya ia mulai meneliti dunia mikroorganisme yang sudah dilihat oleh Pasteur. Pasteur maupun Koch bersama-sama ingin mengetahui penyebab penyakit anthrax yang sangat merugikan peternak sapi dan domba di Eropa. Koch akhirnya menemukan dari darah domba yang telah mati karena anthrax. Dengan sering meninggalkan prakteknya sebagai dokter, Koch membuktikan bahwa bakteri tersebut penyebab anthrax dengan cara memisahkan

bakteri untuk bahan tersebut dari bakteri lain yang ada kemudian menginjeksikannya ke dalam tikus yang sehat. Tikus selanjutnya menunjukkan perkembangan menuju anthrax dan bakteri yang di isolasidari tikus menunjukkan kesamaan bakteri yang berasal dari domba yang sakit sebelumnya.

Pada 1876, setelah meneliti selama 6 tahun Koch mengumumkan bahwa dia telah menemukan bakteri penyebab anthrax. Ia juga menyarankan bahwa ternak sakit supaya dibunuh dan dibakar atau dikubur yang dalam, setelah ia mengetahui bahwa spora yang dihasilkan oleh bakteri dapat bertahan hidup selama berbulan-bulan di daerah peternakan. Dengan penemuan anthraxnya Koch merupakan orang pertama yang membuktikan mikroba tertentu merupakan agen penyakit tertentu.

Selanjutnya Koch dan peneliti lain menemukan bakteri penyebab tuberculosis dan cholera. Perkembangan teknik laboratorium untuk mempelajari mikroorganisme. Koch dan anggotanya banyak memberi kontribusi mengenai teknik-teknik tersebut. Diantaranya adalah prosedur pengecatan bakteri untuk pengamatan dengan mikroskop cahaya. Salah satu kolega Koch adalah Paul Erlich (1854–1915) yang melakukan penelitian terhadap spesimen dan menggunakannya untuk mewarnai bakteri termasuk bakteri penyebab tuberculosis (Robinson, R. K. 1990).

2.2.5        Teknik Biakan Murni

Secara kebetulan seorang pria Jerman melihat bahwa koloni yang tumbuh pada kentang yang telah direbus pada akhirnya dapat menemukan jalan untuk memisah menjadi individu-individu. Caranya: mereka mengembangkan media spesifik untuk menumbuhkan mikroorganisme. Media adalah substansi yang memenuhi kebutuhan nutrisi mikroorganisme. Koch dan koleganya juga menunjukkan senyawa dari alga yang disebut agar dapat membuat media menjadi padat. Richard J. Petri (1852–1921) membuat piringan kaca bertutup untuk menempatkan media agar alat tersebut selanjutnya disebut Petri dish yang masih

digunakan sampai sekarang. Pada tahun 1892, dengan menggunakan teknik biakan murni Koch dan anggotanya menemukan agen-agen penyebab typus, dipteri, tetanus, pneumonia dan lain sebagainya. Koch mengenalkan penggunaan hewan sebagai model untuk penyakit manusia dengan cara menginjeksikan bakteri ke tubuh mencit, kelinci, babi atau domba. Ia bahkan menempelkan kamera pada mikroskopnya untuk mengambil gambar dan menggunakannya sebagai bukti untuk menghilangkan keraguan (Jaweta, E. 1986).

2.2.6        Postulat Koch

Pada tahun 1880, Koch memanfaatkan kemajuan metoda laboratorium dan menentukan kriteria yang diperlukan untuk membuktikan bahwa mikroba spesifik merupakan penyebab penyakit tertentu. Kriteria ini dikenal dengan postulat Koch yaitu:

1.      Mikroorganisme tertentu selalu ditemukan berasosiasi dengan penyakit yang ditimbulkan.

2.      Mikroorganisme dapat diisolasi dan ditumbuhkan sebagai biakan murni di laboratorium.

3.      Biakan murni tersebut bila diinjeksikan pada hewan yang sesuai dapat menimbulkan penyakit.

4.      Mikroorganisme tersebut dapat diisolasi kembali dari hewan yang telah terinfeksi tersebut.

Adanya kriteria tersebut menjadi jalan ditemukannya berbagai bakteri penyebab berbagai penyakit dalam waktu yang cukup singkat (kurang dari 30 tahun). Penemuan virus, adanya bakteri yang dapat menimbulkan berbagai penyakit serta adanya penyakit tertentu yang ditimbulkan oleh lebih dari 1 mikroorganisme memerlukan modifikasi dari postulat Koch.

Pada tahun 1892 Dimitri Ivanovski menunjukkan bahwa agen yang menyebabkan penyakit osaic pada tembakau dapat ditularkan melalui ekstrak tanaman yang sakit. Ekstrak tersebut disaring dengan filter yang ditemukan oleh kawan-kawan Pasteur dimana filter tersebut diketahui dapat menyaring bakteri. Penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa agen tersebut mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil dari bakteri. Yellow fever merupakan penyakit pertama pada manusia yang diketahui disebabkan oleh virus.

Pada tahun 1900 seorang ahli bedah bernama Walter reed (1851 –1902) dengan menggunakan manusia sebagai volunteer membuktikan bahwa virus tersebut dibawa oleh nyamuk tertentu lainnya membwaprotozoa penyebab malaria. Salah satu cara penting untuk mencegah penyakit tersebut adalah menguras air tergenang yang digunakan nyamuk untuk tempat berkembang biak (Jaweta, E. 1986).

2.2.7        Perkembangan dan Pencegahan Penyakit

Epidemik adalah penyakit tertentu yang menyerang banyak daerah misalnya penyakit bubon yang dikenal dengan penyakit hitam yang mematikan yang disebabkan oleh bakteri terjadi di Eropa selama periode tahun 1347–1350. Sepertiga sampai setengah populasi di Eropa meninggal karena penyakit tersebut. Hewan pengerat, terutama tikus, berperan sebagai sumber bakteri basilus dan ditransmisikan/ditularkan ke manusia melalui lalat. Tahun 1917–1919 malaria telah membunuh setengah juta penduduk Amerika dan 21 juta manusia di seluruh dunia. Jumlah tersebut mencapai 3 kali jumlah manusia yang terbunuh selama perang dunia I. Jadi mikroba terbukti lebih mematikan ontainer peluru. Dengan pengetahuan bahwa mikroorganisme dapat merupakan penyebab penyakit ilmuwan lebih memusatkan perhatiannya bagaimana cara pencegahan dan therapinya (Jaweta, E. 1986).

2.2.8        Penemuan Antiseptik

Secara umum septis berarti efek toksis dari mikroorganisme penyebab penyakit pada tubuh selama infeksi. Antiseptik; ukuran-ukuran yang menghentikan efek tersebut dengan pencegahan infeksi. Oliver Weldell Holmes (1809 0 1894) seorang dokter Amerika pada tahun 1843 menekankan bahwa penyakit demam pada wanita bersifat menular. Oleh karena itu ditularkan dari satu wanita lain melalui tangan dokter. Tahun 1846 seorang dokter dari Hungaria, Ignaz Philipp Semmelweiz menemukan penggunaan klorin sebagai desinfektan untuk tangan dokter. Pada tahun 1860 ahli bedah dari Inggris, Joseph Lister menemukan asam karbol atau phenol dapat digunakan untuk membunuh bakteri. Lister menggunakan larutan ini untuk merendam alat-alat bedah dan menyemprot ruangan operasi. Cara tersebut demikian sukses untuk mengatasi infeksi setelah operasi yang sebelumnya menyebabkan kematian 45% dari pasiennya. Cara tersebut segera dapat diterima dan dilakukan oleh ahli bedah yang lain. Penemuan tersebut merupakan hari penemuan teknik ontain untuk mencegah infeksi. Sekarang ini berbagai macam senyawa kimia dan alat fisik lain dapat mengurangi

mikroorganisme di ruang operasi, ruangan untuk bayi ontainer dan ruangan tempat memasukkan obat ke dalam ontainer yang steril (Jaweta, E. 1986).

2.2.9        Imunisasi

Tahun 1880, Pasteur menggunakan teknik dari Konch untuk mengisolasi dan membiakkan bakteri yang menyebabkan kolera pada ayam. Untuk membuktikan penemuannya, Pasteur membuat demonstrasi di hadapan publik tentang percobaannya yang telah dilakukan berulang kali di laboratorium. Dia menginjeksikan biakan bakteri kolera pada ayam sehat dan menunggunya sampai ayam tersebut menunjukkan gejala penyakit. Akan tetapi hasilnya membuat Pasteur mendapat malu karena ayamnya tetap hidup dan sehat. Pasteur kemudian mengevaluasi langkahlangkah yang menyebabkan demonstrasi tersebut gagal. Dia menemukan bahwa secara kebetulan dia menggunakan biakan tua seperti yang telah dilakukan sebelumnya, dan satu kelompok adalah ayam yang tidak pernah diinokulasi. Selanjutnya kedua kelompok ayam tersebut diinjeksi dengan biakan segar. Hasilnya, kelompok ayam yang kedua mati sedang kelompok ayam pertama tetap sehat. Hal ini mebuatnya bingung, tetapi pasteur segara menemukan

jawabannya. Pasteur menemukan bahwa, bakteri jika dibiarkan tumbuh menjadi biakan tua menjadi avirulen yaitu kehilangan virulensinya atau kemampuan untuk menyebakan penyakit. Tetapi bakteri avirulen ini masih dapat menstimulasikan sesuatu dalam tubuh host dan pada infeksi berikutnya menjadi imun atau tahan terhadap penyakit. Pasteur selanjutnya menerapkan prinsip imunisasi untuk mencegah anthrax. Pasteur menyebutkan bakteri yang telah avirulen tersebut dengan vaccine dari bahasa latin ”vacca” artinya sapi dan imunisasi dengan biakan tersebut dikenal dengan vaksinasi.

Dengan vaksinasi tersenut Pasteur mengenali mengetahui hasil kerja sebelumnya oleh Edward Jenner (1823-1949) yang telah sukses memvaksinasikan para pekerjanya di peternakan yang telah terkena cowpox dari ternak sapinya tetapi tidak pernah berkembang menjadi serius. Jenner menduga bahwa menghadapi cawpox akan mencegahnya dari serangan smallpox. Untuk membuktikan hipotesisnya Jenner menginokulasi pendapat dari James Philips pertama dengan materi yang menyebabkan cowpox yang diambil dari luka, kemudian dari agen smallpox. Anak laki-laki tersebut tidak menununjukkan gejala smallpox. Nama Pasteur selanjutnya dikenal dimana-mana banyak orang dianggap

sebagai peneliti tentang mikroorganisme yang azaib. Untuk itu ia diminta membuat vaccin pencegah hidrofobia atau rabies, penyakit yang ditularkan ke manusia melalui gigitan anjing, kucing atau hewan yang terinfeksi lainnya.                        

Pasteur adalah seorang ahli kimia, bukan dokter dan Pasteur tidak biasa memperlakukan manusia. Disamping kenyataan bahwa penyebab penyakit rabies belum diketahui, tetapi Pasteur mempunyai keyakinan yang kuat bahwa itu adalah mikroorganisme. Ia dapat membuat kelinci terkena penyakit setelah diinokulasi dengan saliva anjing. Selanjutnya Pasteur dan asistennya mengambil otak dan tulang belakang kelinci tersebut dan menginginkannya dan membuatnya menjadi larutan. Anjing yang diinokulasi dengan campuran tersebut dapat terhindar dari rabies. Akan tetapi vaksinasi terhadap anjing sangat berbeda dengan manusia. Pada bulan Juli 1885, seorang anak laki-laki bernama Joseph Meister digigit oleh serigala dan keluarganya membujuk Pasteur untuk menginokulasi anak tersebut Kekawatiran Pasteur dan orang-orang menjadi berkurang setelah anak laki-laki tersebut tidak mati. Selanjutnya Pasteur menjadi terkenal dan memperoleh banyak dana yang kemudian digunakan untuk mendirikan Institute Pasteur di Paris yang sangat terkenal (Jaweta, E. 1986).

2.3  Faktor Lingkungan yang mempengaruhi Mikroba

Pola pertumbuhan, laju pertumbuhan, dan jumlah total bakteri dipengaruhi oleh suhu, gas oksigen, dan pH. Setiap spesies bakteri tumbuh pada kisaran suhu tertentu. Bakteri psikrojl mampu tumbuh pada suhu minimum 0-5 ˚C, optimum 5-15 ˚C, dan maksimum 15-20 OC. Bakteri mesofil dapat tumbuh pada suhu minimum 10-20 ˚C, optimum 20-40 ˚C, dan maksimum 40-45 OC. Bakteri yang dapat tumbuh pada suhu minimum 25-45 ˚C, optimum 45-60 ˚C, dan maksimum 60-80 ˚C disebut dengan bakteri termofil (Lay 1994). Pada Tabel 2 menunjukkan karakteristik suhu pada laut dalam, bakteri yang mampu hidup di dalamnya adalah jenis psikrofil. Kelompok bakteri ini sering tumbuh pada makanan yang didinginkan karena masih dapat tumbuh pada suhu sedikit di atas suhu pembekuan. Bakteri termofil sering tumbuh pada makanan yang disimpan pada suhu tinggi, contoh bakterinya adalah Bacillus thermophilus yang dapat menyebabkan kebusukan asam tanpa gas. Clostridium thermosaccharolythicum penyebab busuk kembung pada makanan kaleng dan Lactobacillus thermophilus yang merupakan bakteri asam laktat termofil (Fardiaz 1992).

Pertumbuhan bakteri juga dipengaruhi oleh adanya keberadaan gas atmosfer seperti oksigen dan karbondioksida. Terdapat empat kelompok besar bakteri, yaitu aerobik adalah organisme yang membutuhkan oksigen, anaerobik adalah organisme yang tidak memerlukan oksigen dalam hidupnya, anaerobic fakultatif adalah organisme yang dapat tumbuh dalam lingkungan aerobik maupun anaerobik, mikroaerofilik adalah organisme yang tumbuh dengan baik jika hanya ada sedikit oksigen dalam lingkungannya (Pelczar dan Chan ,1986).

Sebagian besar bakteri tumbuh dengan baik pada pH 6,5-7,5. Namun, terdapat sebagian bakteri yang mampu tumbuh pada lingkungan yang sangat asam maupun sangat basa. Perubahan pH pada medium bakteri ini dapat disebabkan

oleh senyawa yang dihasilkan bakteri tersebut selama pertumbuhannya. Untuk

menjaga kondisi seperti pH awal, maka ke dalam medium biakan ditambahkan

larutan penyangga. Beberapa senyawa yang berfungsi sebagai penyangga adalah pepton maupun kombinasi garam pospat (Pelczar dan Chan 1986).

Peran utama nutrisi adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. Jasad hidup ada yang dapat menggunakan sumber nutrient didalam bentuk padat, ada pula yang hanya dapat menggunakan dalam bentuk cairan (larutan).

Jasad hidup yang dapat menggunakan sumber nutrient dalam bentuk padat tergolong dalam tipe holozoik, sedang yang menggunakan nutrient didalam bentuk cairan tergolong ke dalam tipe holofitik. Jasad holofitik dapat pula menggunakan sumber nutrient dalam bentuk padat, tetapi bahan tersebut harus diencerkan terlebih dahulu diluar sel dengan pertolongan enzim ekstraseluler.

Sumber nutrien yang sangat diperlukan adalah dalam bentuk : ( Suriawiria , 2005).

1. Air

            Air merupakan komponen utama sel mikroba dan medium. Fungsi air adalah sebagai sumber oksigen untuk bahan organik sel pada respirasi. Selain itu air berfungsi sebagai pelarut dan alat pengangkut dalam metabolisme.

2. Sumber energi

Ada beberapa sumber energi untuk mikroba yaitu senyawa organik atau anorganik yang dapat dioksidasi dan cahaya terutama cahaya matahari.

3. Sumber karbon

Sumber karbon untuk mikroba dapat berbentuk senyawa organik maupun anorganik. Senyawa organik meliputi karbohidrat, lemak, protein, asam amino, asam organik, garam asam organik, polialkohol, dan sebagainya. Senyawa anorganik misalnya karbonat dan gas CO2 yang merupakan sumber karbon utama terutama untuk tumbuhan tingkat tinggi.

4. Sumber aseptor elektron

Proses oksidasi biologi merupakan proses pengambilan dan pemindahan elektron dari substrat. Karena elektron dalam sel tidak berada dalam bentuk bebas, maka harus ada suatu zat yang dapat menangkap elektron tersebut. Penangkap elektron ini disebut aseptor elektron. Aseptor elektron ialah agensia pengoksidasi. Pada mikrobia yang dapat berfungsi sebagai aseptor elektron ialah O2, senyawa organik, NO3^-, NO2^-, N2O, SO4 ⁺, CO2, dan Fe3⁺.

5. Sumber mineral

Mineral merupakan bagian dari sel. Unsur penyusun utama sel ialah C, O, N, H, dan P. unsur mineral lainnya yang diperlukan sel ialah K, Ca, Mg, Na, S, Cl. Unsur mineral yang digunakan dalam jumlah sangat sedikit ialah Fe, Mn, Co, Cu, Bo, Zn, Mo, Al, Ni, Va, Sc, Si, Tu, dan sebagainya yang tidak diperlukan jasad. Unsur yang digunakan dalam jumlah besar disebut unsur makro, dalam jumlah sedang unsur oligo, dan dalam jumlah sangat sedikit unsur mikro. Unsur mikro sering terdapat sebagai ikutan (impurities) pada garam unsur makro, dan dapat masuk ke dalam medium lewat kontaminasi gelas tempatnya atau lewat partikel debu. Selain berfungsi sebagai penyusun sel, unsur mineral juga berfungsi untuk mengatur tekanan osmose, kadar ion H+ (kemasaman, pH), dan potensial oksidasireduksi (redox potential) medium.

6. Faktor tumbuh

Faktor tumbuh ialah senyawa organik yang sangat diperlukan untuk pertumbuhan (sebagai prekursor, atau penyusun bahan sel) dan senyawa ini tidak dapat disintesis dari sumber karbon yang sederhana. Faktor tumbuh sering juga disebut zat tumbuh dan hanya diperlukan dalam jumlah sangat sedikit. Berdasarkan struktur dan fungsinya dalam metabolisme, faktor tumbuh digolongkan menjadi asam amino, sebagai penyusun protein base purin dan pirimidin, sebagai penyusun asam nukleat, dan vitamin sebagai gugus prostetis atau bagian aktif dari enzim.

7. Sumber nitrogen

Mikroba dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk amonium, nitrat, asam amino, protein, dan sebagainya. Jenis senyawa nitrogen yang digunakan tergantung pada jenis jasadnya. Beberapa mikroba dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk gas N₂ (zat lemas) udara. Mikroba ini disebut mikrobia penambat nitrogen.

Makhluk hidup menggunakan sumber-sumber nutrient dapat dalam bentuk padat, tetapi ada juga yang hanya dapat menggunakan sumber nutrient dalam bentuk cair (larutan). Bila jasad hidup menggunakan sumber nutrient dalam bentuk padat digolongkan tipe holozoik, sedangkan yang menggunakan nutrient dalam bentuk cairan tergolong tipe holofitik. Namun ada hidup holofitik dapat juga menggunakan sumber nutrient dalam bentuk padat, tetapi bahan tersebut dicerna dahulu diluar sel dengan bantuan enzim ekstraseluler.

Tabel 1. Unsur utama, sumber dan fungsi nutrisi dalam sel bakteri.

Elemen	% dari berat kering	Sumber	Fungsi
Karbon	50	Kompleks organik atau CO2	material utama dari bahan selular
Oksigen	20	H 2O, Kompleks organik,CO2, dan O 2	Konstituen dari sel dan sel bahan air; O2 adalah menerima elektron dalam respirasi aerobic
Nitrogen	+14	NH 3, NO3, Kompleks organik, N2	Konstituen dari asam amino, asam nukleik nucleotides, dan coenzymes
Hidrogen	8	H2O, Kompleks organik, H 2	Utama dari organik memanjang dan sel air
Fosfor	3	anorganik Fosfat (PO4)	Konstituen dari asam nukleik, nucleotides, phospholipids, LPS, teichoic asam
Belerang	1	SO4, H 2S, S, belerang organik memanjang	Konstituen dari cysteine, methionine,glutathione, beberapa coenzymes
Kalium	1	Kalium garam dapur	Utama selular anorganik gigih dan cofactor untuk enzim tertentu
Magnesium	0.5	Magnesium garam dapur	Anorganik selular dengan gigih, cofactor tertentu untuk reaksi enzimatis
Kalsium	0.5	Kalsium garam dapur	Anorganik selular dengan gigih, cofactor untuk enzim tertentu dan komponen endospores
Besi	0.2	Garam dapur besi	Komponen tertentu cytochromes dan nonheme-besi dan protein yang cofactor untuk beberapa reaksi enzimatis

Pengelompokan mikroorganisme berdasarkan zat gizi

Semua para ahli makhluk hidup hanya mengenal pembagian organisme berdasarkan akan kebutuhan zat gizi adalah ototrof yang ditunjukkan oleh tumbuhan, yakni organisme yang dapat menggunakan seluruh zat gizi anorganik; dan heterotrof, yang ditunjukkan oleh hewan, yang memerlukan zat gizi organik. Sekarang, kedua kelompok ini tidak cukup menunjukkan keragaman pola gizi yang diketahui ada di dunia hidup, dan bermacam-macam usaha untuk membuat sistem yang lebih seksama untuk klasifikasi mengenai gizi.

Klasifikasi mikroorganisme berdasrkan zat gizi didasari oleh dua parameter, yakni sifat sumber energi dan sifat sumber karbon yang utama. Selanjutnya mengenai sumber energy, terdapat dikotomi, yakni fototrof merupakan organisme yang menggunakan cahaya sebagai sumber energi dan kemotrof yang merupakan organisme yang menggunakan senyawa anorganik sederhana sebagai sumber enegi. Sedangkan pembagian organisme berdasarkan sifat sumber karbon utama, yaitu organisme ototrof yang merupakan organisme yang menggunakan karbon dioksida sebagai sumber karbon utama atau untuk pertumbuhan; dan organisme hetrotof, merupakan organisme bergantung pada sumber karbon organik.

Pada tipe mikroba heterotrof, baik yang fotoheterotrof dan kemoheterotrof terdapat perbedaan antar mikroba saprofit dengan bakteri parasit. Bakteri saprofit disebut juga saprobakteri atau saproba (sapros=sampah), yakni kelompok mikroba yang hidup dari zat-zat organic yang telah berupa sisa-sisa atau sampasedangkan mikroba parasit yang dapat dipiara diluar hospes, dinamakan mikroba parasit fakultatif dan mikroba yang tidak mungkin hidup kecuali pada ,hospesnya dinamakan mikroba parasit obligat. Sedangkan mikroba yang menyebabkan penyakit yang dapat mengganggu hospesnya disebut mikroba pathogen.

Berkaitan dengan masalah pembagian mikroba berdasarkan zat gizi, ada bebrapa istilah yang menyatakan keadaan fisis pada waktu zat organik memasuki sel, yakni :

1.      Osmotrof, yakni organisme yang mengambil semua zat gizi dalam bentuk larutan. Misalnya, bakteri dan cendawan.

2.      Fagotrof, yaitu organisme yang dapat mengambil partikel makanan padat dengan mekanisme yang dinamakan fagositosis. Misalnya protozoa.

3.      Auksotrof, yakni organisme yang disamping memerlukan sumber karbon utama, juga tambahan satu atau lebih zat organik (faktor tumbuh). Misalnya pada banyak alga dan bakteri fotoototrof (Lud Waluyo, 2004).

2.3.1        Berdasarkan sumber karbon

Berdasarkan atas kebutuhan karbon jasad dibedakan menjadi jasad ototrof dan heterotrof. Jasad ototrof ialah jasad yang memerlukan sumber karbon dalam bentuk anorganik, misalnya CO2 dan senyawa karbonat. Jasad heterotrof ialah jasad yang memerlukan sumber karbon dalam bentuk senyawa organik. Jasad heterotrof dibedakan lagi menjadi jasad saprofit dan parasit. Jasad saprofit ialah jasad yang dapat menggunakan bahan organik yang berasal dari sisa jasad hidup atau sisa jasad yang telah mati. Jasad parasit ialah jasad yang hidup di dalam jasad hidup lain dan menggunakan bahan dari jasad inang (hospes)-nya. Jasad parasit yang dapat menyebabkan penyakit pada inangnya disebut jasad patogen.

2.3.2        Berdasarkan sumber energi

Berdasarkan atas sumber energi jasad dibedakan menjadi jasad fototrof, jika menggunakan energi cahaya dan khemotrof, jika menggunakan energi dari reaksi kimia. Jika didasarkan atas sumber energi dan karbonnya, maka dikenal jasad fotoototrof, fotoheterotrof, khemoototrof dan khemoheterotrof. Perbedaan dari keempat jasad tersebut sbb:

Jasad Sumber Karbon Sumber Energi

Fotoototrof                    Zat anorganik                          Cahaya matahari

Fotoheterotrof      Zat organik                                      Cahaya matahari

Khemotrof            Zat anorganik                     Oksidasizatanorganik

Khemoheterotrof    Zat organic                            Oksidasi zat organik

2.3.3        Berdasarkan sumber donor elektron

Berdasarkan atas sumber donor elektron jasad digolongkan manjadi jasad litotrof dan organotrof. Jasad litotrof ialah jasad yang dapat menggunakan donor elektron dalam bentuk senyawa anorganik seperti H₂, NH₃, H₂S dan S. jasad organotrof ialah jasad yang menggunakan donor elektron dalam bentuk senyawa organik.

2.3.4        Berdasarkan sumber energi dan donor elektron

Berdasarkan atas sumber energi dan sumber donor elektron jasad dapat digolongkan menjadi jasad fotolitotrof, fotoorganotrof, khemolitotrof, dan khemoorganotrof. Perbedaan keempat golongan jasad tersebut sbb:

Jasad	Sumber Energi	Sumber Donor Elektro	Contoh
Fotolitotrof	Cahaya	Zat anorganik	Tumbuhan tingkat tinggi, alga
Fotoorganotrof	Cahaya	Zat organik	Bakteri belerang fotosintetik
Khemolitotrof	Oksidasi zat	Zat anorganik	Bakteri besi, bakteri Khemoorganotrof
heterotrof	Oksidasi zat organic	Zat organik	hidrogen, bakteri nitrifikasi

Berdasarkan kebutuhan oksigen

Berdasarkan akan kebutuhan oksigen, jasad dapat digolongkan dalam jasad aerob, anaerob, mikroaerob, anaerob fakultatif, dan kapnofil. Pertumbuhan mikroba di dalam media cair dapat menunjukkan sifat berdasarkan kebutuhan oksigen.

Obligat aerob Fakultatif anaerob Obligat anaerob Aerotoleran/Anaerob Mikroaerofil Jasad aerob ialah jasad yang menggunakan oksigen bebas (O₂) sebagai satusatunya aseptor hidrogen yang terakhir dalam proses respirasinya. Jasa anaerob, sering disebut anaerob obligat atau anaerob 100% ialah jasad yang tidak dapat menggunakan oksigen bebas sebagai aseptor hidrogen terakhir dalam proses respirasinya. Jasad mikroaerob ialah jasad yang hanya memerlukan oksigen dalam jumlah yang sangat sedikit. Jasad aerob fakultatif ialah jasad yang dapat hidup dalam keadaan anaerob maupun aerob. Jasad ini juga bersifat anaerob toleran. Jasad kapnofil ialah jasad yang memerlukan kadar oksigen rendah dan kadar CO₂ tinggi.

Interaksi Antar Mikroba Dalam Menggunakan Nutrien

Jika dua atau lebih mikroba yang berbeda ditumbuhkan bersama-sama dalam suatu medium, maka aktivitas metabolismenya secara kualitatif maupun kuantitatif akan berbeda jika dibandingkan dengan jumlah aktivitas masing-masing mikroba yang ditumbuhkan dalam medium yang sama tetapi terpisah. Fenomena ini merupakan hasil interaksi metabolisme atau interaksi dalam penggunaan nutrisi yang dikenal sebagai sintropik atau sintropisme atau sinergitik. Sebagai contoh ialah bakteri penghasil metan yang anaerob obligat tidak dapat menggunakan glukosa sebagai substrat, tetapi bakteri tersebut akan segera tumbuh oleh adanya hasil metabolisme bakteri anaerob lain yang dapat menggunakan glukosa ( Rachdie. 2006).

-           Pola Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan untuk bakteri dan mikroorganisme lain pada umurnnya mengacu pada perubahan di dalarn hasil panen sel (pertambahan total massa sel) dan bukan perubahan individu organisme. Selama fase pertumbuhan seimbang (balanced growth) pertambahan massa bakteri berbanding lurus dengan pertambahan komponen seluler yang lain seperti DNA, RNA, dan protein. Cara reproduksi sebagian besar bakteri adalah pembelahan biner, satu sel membelah diri menghasilkan dua sel. Selang waktu yang dibutuhl~an bagi sel untuk membelah diri dikenal sebagai waktu generasi. Waktu generasi setiap spesies dengan kondisi berbeda mempunyai perbedaan. Pelczar dan Chan (1986) menyatakan bahwa waktu generasi tergantung pada jumlah bakteri yang ada pada awalnya, yaitu di dalam inokulum, jumlah bakteri yang ada pada akhir waktu tertentu dan interval waktu. Pola fase pertumbuhan bakteri adalah pola eksponensial atau logaritma (fase log). Pada fase ini, populasi bakteri bertambah secara teratur menjadi dua kali lipat pada interval waktu tertentu selama inkubasi.

menunjukkan bahwa pada periode awal tanpa pertumbuhan (fase lamban), diikuti fase kedua adalah periode pertumbuhan cepat (fase log), kemudian mendatar (fase statis), dan akhirnya adalah suatu fase penurunan populasi sel-sel hidup (fase kematian).

Fase adaptasi terjadi 1-2 jam paska pemindahan kultur. Bakteri mengalami perbesaran ukuran sel, peningkatan metabolisme, dan mulai menyesuaikan dengan kondisi lingkungan yang baru. Pada fase pertumbuhan terjadi pembelahan yang menyebabkan bertambahnya populasi bakteri hingga mencapai titik stationernya. Pada fase stationer, bakteri sudah tidak mengalami pertambahan populasi, dan

pada akhirnya karena ketersediaan nutrien yang terbatas terjadi fase kamatian.

Pada fase kematian jumlah populasi bakteri semakin berkurang karena persaingan zat makanan antar bakteri (Rachdie. 2006).

2.4  Peranan Mikroba Secara Umum

Mikroorganisme merupakan jasad hidup yang mempunyai ukuran sangat kecil (Kusnadi, 2003). Setiap sel tunggal mikroorganisme memiliki kemampuan untuk melangsungkan aktivitas kehidupan antara lain dapat dapat mengalami pertumbuhan, menghasilkan energi dan bereproduksi dengan sendirinya. Mikroorganisme memiliki fleksibilitas metabolisme yang tinggi karena mikroorganisme ini harus mempunyai kemampuan menyesuaikan diri yang besar sehingga apabila ada interaksi yang tinggi dengan lingkungan menyebabkan terjadinya konversi zat yang tinggi pula. Akan tetapi karena ukurannya yang kecil, maka tidak ada tempat untuk menyimpan enzim-enzim yang telah dihasilkan. Dengan demikian enzim yang tidak diperlukan tidak akan disimpan dalam bentuk persediaan.enzim-enzim tertentu yang diperlukan untuk perngolahan bahan makanan akan diproduksi bila bahan makanan tersebut sudah ada.

        Mikroorganisme ini juga tidak memerlukan tembat yang besar, mudah ditumbuhkan dalam media buatan, dan tingkat pembiakannya relatif cepat (Darkuni, 2001). Oleh karena aktivitasnya tersebut, maka setiap mikroorganisme memiliki peranan dalam kehidupan, baik yang merugikan maupun yang menguntungkan.

           Sekilas, makna praktis dari mikroorganisme disadari tertutama karena kerugian yang ditimbulkannya pada manusia, hewan, dan tumbuh-tumbuhan. Misalnya dalam bidang mikrobiologi kedokteran dan fitopatologi banyak ditemukan mikroorganisme yang pathogen yang menyebabkan penyakit dengan sifat-sifat kehidupannya yang khas. Walaupun di bidang lain mikroorganisme tampil merugikan, tetapi perannya yang menguntungkan jauh lebih menonjol. Menurut Schlegel ( 1994) beberapa bukti mengenai peranan mikrobiologi dapat dikemukakan sebagai berikut:

2.4.1        Proses klasik menggunakan mikroorganisme

Di Jepang dan Indonesia sudah sejak zaman dahulu kacang kedelai diolah dengan menggunakan bantuan fungi, ragi, dan bakteri asam laktat. Bahkan sudah sejak zaman perang dunia pertama fermentasi terarah dengan ragi digunakan untuk membuat gliserin. Asam laktat dan asam sitrat dalam jumlah besar yang diperlukan oleh industri makanan, masing-masing dibuat dengan pertolongan bakteri asam laktat dan cendawan Aspergillus niger.

2.4.2        Produk Antibiotika

Penemuan antibiotik telah menghantarkan pada terapi obat dan industri obat ke era baru. Karena adanya penemuan penisilin dan produk-produk lain sekresi fungi, aktinomiset, dan bakteri lain, maka kini telah tersedia obat-obat yang manjur untuk memerangi penyakit infeksi bakteri.

2.4.3        Proses menggunakan mikroba

Fermentasi klasik telah diganti dengan cara baru untuk produksi dan konversi menggunakan mikroba. Senyawa karotenoid dan steroid diperoleh dari fungi. Sejak ditemukan bahwa Corynebacterium glutamicum memproduksi glutamat dengan rendemen tinggi dari gula dan garam amonium, maka telah diisolasi berbagai mutan dan dikembangkan proses baru yang memungkinkan pembuatan banyak jenis asam amino, nukleotida, dan senyawabiokimia lain dalam jumlah besar. Mikroorganisme juga diikutsertakan oleh para ahli kimia pada katalisis sebagian proses dalam rangkaian sintesis yang panjang; biokonversi oleh mikroba lebih spesifik dengan rendemen lebih tinggi, mengungguli koversi secara kimia; amilase untuk hidrolisis pati, proteinase pada pengolahan kulit, pektinase untuk penjernihan sari buah dan enzim-enzim lain yang digunakan di industri diperoleh dari biakan mikroorganisme.

2.4.4        Posisi monopoli dari mikroorganisme

Beberapa bahan dasar yang terutama tersedia dalam jumlah besar, seperti minyak bumi, gas bumi, dan selulosa hanya dapat diolah oleh mikroorganisme dan dapat mengubahnya kembali menjadi bahan sel (biomassa) atau produk antara yang disekresi oleh sel.

2.4.5        Teknik genetika modern

Kejelasan mengenai mekanisme pemindahan gen pada bakteri dan peran dari unsur-unsur ekstrakromosom, telah membuka kemungkinan untuk memindahkan DNA asing ke dalam bakteri. Manipulasi genetik memungkinkan untuk memasukkan sepotong kecil pembawa informasi genetik dari manusia ke dalam bakteri sehingga terjadi sintesis senyawa protein yang bersangkutan. Kegiatan ini sering dilakukan dalam hal pembuatan hormon, antigen, dan antibodi.

Berdasarkan penjelasan di atas, mikroorganisme memiliki peranan yang cukup besar dalam kehidupan, baik peranan yang merugikan maupun yang menguntungkan.

Beberapa peranan yang dimiliki oleh mikroorganisme antara lain sebagai berikut:

2.4.6        Peranan yang Merugikan

• Penyebab penyakit, baik pada manusia, hewan maupun tumbuhan Misalnya Strptococcus pneumoniae penyebab pneumonia dan Corynebacterium diphtheriae penyebab dipteri.

• Penyebab kebusukan makanan (spoilage)

Adanya kebusukan pada makanan dapat disebabkan oleh beberapa jenis bakteri yang tumbuh dalam makanan tersebut. Beberapa di antara mikroorganisme dapat mengubah rasa beserta aroma dari makanan sehingga dianggap merupakan mikroorganisme pembusuk. Dalam pembusukan daging, mikroorganisme yang menghasilkan enzim proteolitik mampu merombak protein-protein. Pada proses pembusukan sayur dan buah, mikroorganisme pektinolitik mampu merombak bahan-bahan yang mengandung pektin yang terdapat pada dinding sel tumbuhan (Tarigan, 1988). Mikroorganisme seperti bakteri, khamir (yeast) dan kapang (mould) dapat menyebabkan perubahan yang tidak dikehendaki pada penampakan visual, bau, tekstur atau rasa suatu makanan. Mikroorganisme ini dikelompokkan berdasarkan tipe aktivitasnya, seperti proteolitik, lipolitik, dll. Atau berdasarkan kebutuhan hidupnya seperti termofilik, halofilik dan lain-lain.

• Penyebab keracunan makanan (food borne disease).

        Kusnadi (2003) menjelaskan bahwa bakteri penghasil racun (enterotoksin atau eksotoksin) dapat mencemari badan air, misalnya spora Clostridium perfringens, C. Botulinum, Bacillus cereus, dan Vibrio parahaemolyticus. Spora dapat masuk ke dalam air melalui debu/tanah, kotoran hewan, dan makanan-limbah. Jika makanan atau minuman dan air bersih tercemari air tersebut, maka dalam keadaan yang memungkinkan, bakteri tersebut akan mengeluarkan racun sehingga makanan atau minuman mengandung racun dan bila dikonsumsi dapat menyebabkan keracunan makanan. Bahkan menurut Dwidjoseputro (2005) pada makanan yang telah dipasteurisasi pun juga dapat mengandung racun (toksin) . Makanan yang telah dipasteurisasi kemudian terus menerus disimpan di dalam kaleng pada athogenre kamar, dapat mengandung racun yang berasal dari Clostridium botulinum. Spora-spora dari bakteri ini tidak mati dalam proses pasteurisasi. Dalam keadaan tertutup (anaerob) dan suhu yang menguntungkan, maka spora-spora tersebut dapat tumbuh menjadi bakteri serta menghasilkan toksin. Racun yang dihasilkan tidak mengganggu alat pencernaan, melainkan mengganggu urat saraf tepi.

·         Menimbulkan pencemaran

Materi fekal yang masuk ke dalam badan air, selain membawa bakteri athogen juga akan membawa bakteri pencemar yang merupakan flora normal saluran pencernaan manusia, misalnya E. coli. Kehadiran bakteri ini dapat digunakan sebagi indicator pencemaran air oleh materi fekal.

2.4.7        Peranan yang Menguntungkan

Banyak yang menduga bahwa mikroorganisme membawa dampak yang merugikan bagi kehidupan hewan, tumbuhan, dan manusia, misalnya pada bidang mikrobiologi kedokteran dan fitopatologi banyak ditemukan mikroorganisme yang pathogen yang menyebabkan penyakit dengan sifat-sifat kehidupannya yang khas. Meskipun demikian, masih banyak manfaat yang dapat diambil dari mikroorganisme-mikroorganisme tersebut. Penggunaan mikroorganisme dapat diterapkan dalam berbagai bidang kehidupan, saperti bidang pertanian, kesehatan, dan lingkungan.

Beberapa manfaat yang dapat diambil antara lain sebagai berikut :

-          Bidang pertanian

Dalam bidang pertanian, mikroorganisme dapat digunakan untuk peningkatan kesuburan tanah melalui fiksasi N₂, siklus nutrien, dan peternakan hewan. Nitrogen bebas merupakan komponen terbesar udara. Unsur ini hanya dapat dimanfaatkan oleh tumbuhan dalam bentuk nitrat dan pengambilan khususnya melalui akar. Pembentukan nitrat dari nitrogen ini dapat terjadi karena adanya mikroorganisme. Penyusunan nitrat dilakukan secara bertahap oleh beberapa genus bakteri secara sinergetik.

Dalam Dwidjoseputro (2005) dijelaskan bahwa ada beberapa genera bakteri yang hidup dalam tanah (misalnya Azetobacter, Clostridium, dan Rhodospirillum) mampu untuk mengikat molekul-molekul nitrogen guna dijadikan senyawa-senyawa pembentuk tubuh mereka, misalnya protein. Jika sel-sel itu mati, maka timbullah zat-zat hasil urai seperti CO₂ dan NH₃ (gas amoniak). Sebagian dari amoniak terlepas ke udara dan sebagian lain dapat dipergunakan oleh beberapa genus bakteri (misalnya Nitrosomonas dan Nitrosococcus) untuk membentuk nitrit. Nitrit dapat dipergunakan oleh genus bakteri yang lain untuk memperoleh energi daripadanya. Oksidasi amoniak menjadi nitrit dan oksidasi nitrit menjadi nitrat berlangsung di dalam lingkungan yang aerob. Peristiwa seluruhnya disebut nitrifikasi. Pengoksidasian nitrit menjadi nitrat dilakukan oleh Nitrobacter.

Proses nitrifikasi ini dapat ditulis sebagai berikut :

2NH₃ + 3O₂ ­­­­­­­­­­­­­­­­­ Nitrosomonas, Nitrosococcus 2HNO₂ + 2H₂O + energi

2HNO₂ + O₂ Nitrobacter 2HNO₃ + energi

_­ Selain itu, mikroorganisme ini juga dapat digunakan sebagai agen pembusuk alami, yang akan mendekomposisi sampah-sampah organik menjadi materi inorganik sehingga dapat mengurangi kuantitas sampah, menyuburkan tanah dan dapat menjadi sumber nutrisi bagi tumbuhan .Seorang peneliti dari Amerika Serikat yaitu Waksman telah menemukan mikroorganisme tanah yang menghasilkan streptomisin, yaitu bakteri Streptomyces (Dwidjoseputro, 2005).

Peran lain mikroba dalam bidang pertanian antara lain dalam teknologi kompos bioaktif dan dalam hal penyediaan dan penyerapan unsur hara bagi tanaman (biofertilizer). Kompos bioaktif adalah kompos yang diproduksi dengan bantuan mikroba lignoslulotik unggul yang tetap bertahan di dalam kompos dan berperan sebagai agensia hayati pengendali penyakit tanaman. Teknologi kompos bioaktif ini menggunakan mikroba biodekomposer yang mampu mempercepat proses pengomposan dari beberapa bulan menjadi beberapa minggu saja. Mikroba akan tetap hidup dan aktif di dalam kompos, dan ketika kompos tersebut diberikan ke tanah, mikroba akan berperan untuk mengendalikan organisme.

Dalam hal penyediaan dan penyerapan unsur hara bagi tanaman (biofertilizer), aktivitas mikroba diperlukan untuk menjaga ketersediaan tiga unsur hara yang penting bagi tanaman antara lain, Nitrogen (N), fosfat (P), dan kalim (K). Kurang lebih 74% kandungan udara adalah N. Namun, N udara tersebut harus ditambat oleh mikroba dan diubah bentuknya terlebih dahulu agar bisa langsung dimanfaatkan oleh tanaman. Mikroba penambat N ada yang hidup bebas dan ada pula yang bersimbiosis. Mikroba penambat N simbiotik antara lain : Rhizobium sp yang hidup di dalam bintil akar tanaman kacang-kacangan (leguminose ). Mikroba penambat N non-simbiotik misalnya: Azospirillum sp dan Azotobacter sp. Mikroba penambat N simbiotik hanya bisa digunakan untuk tanaman leguminose saja, sedangkan mikroba penambat N non-simbiotik dapat digunakan untuk semua jenis tanaman.

Mikroba tanah lain yang berperan dalam penyediaan unsur hara adalah mkroba pelarut unsur fosfat (P) dan kalium (K). Kandungan P yang cukup tinggi (jenuh) pada tanah pertanian kita, sedikit sekali yang dapat digunakan oleh tanaman karena terikat pada mineral liat tanah. Di sinilah peran mikroba pelarut P yang melepaskan ikatan P dari mineral liat dan menyediakannya bagi tanaman. Banyak sekali mikroba yang mampu melarutkan P, antara lain: Aspergillus sp, Penicillium sp, Pseudomonas sp dan Bacillus megatherium. Mikroba yang berkemampuan tinggi melarutkan P, umumnya juga berkemampuan tinggi dalam melarutkan K.

Mikroba sebagai agen biokontrol. Mikroba yang dapat mengendalikan hama tanaman antara lain: Bacillus thurigiensis (BT), Bauveria bassiana , Paecilomyces fumosoroseus, dan Metharizium anisopliae . Mikroba ini mampu menyerang dan membunuh berbagai serangga hama. Mikroba yang dapat mengendalikan penyakit tanaman misalnya: Trichoderma sp yang mampu mengendalikan penyakit tanaman yang disebabkan oleh Gonoderma sp, JAP (jamur akar putih), dan Phytoptora sp. Beberapa biokontrol yang tersedia di pasaran antara lain : Greemi-G, Bio-Meteor, NirAma, Marfu-P dan Hamago (Thieman, 2004).

Gambar 1. Endomikoriza yang berperan melarutkan P

Gambar 2. Larva serangga yang mati diserang jamur biokontrol

Gambar 3. Bakteri yang unggul dalam melarutkan fosfat

Gambar 4. Jamur yang unggul dalam melarutkan fosfat

-          Bidang makanan dan industri

Beberapa bahan makanan yang sampai saat ini dibuat dengan menggunakan mikroorganisme sebagai bahan utama prosesnya, misalnya pembuatan bir dan minuman anggur dengan menggunakan ragi, pembuatan roti dan produk air susu dengan bantuana bakteri asam laktat, dan pembuatan cuka dengan bantuan bakteri cuka.

Pengolahan kacang kedelai di beberapa negara banyak yang menggunakan bantuan fungi, ragi, dan bakteri bakteri asam laktat. Bahkan asam laktat dan asam sitrat yang dalam jumlah besar diperlukan oleh industri bahan makanan masing-masing dibuat dengan bantuan asam laktat dan Aspergillus niger (Darkuni, 2001). Beberqapa kelompok mikroorganisme dapat digunakan sebagai indikator kualitas makanan. Mikroorganisme ini merupakan kelompok bakteri yang keberadaannya di makanan di atas batasan jumlah tertentu, yang dapat menjadi indikator suatu kondisi yang terekspos yang dapat mengintroduksi organisme hazardous (berbahaya) dan menyebabkan proliferasi spesies patogen ataupun toksigen. Misalnya E. coli tipe I, coliform dan fekal streptococci digunakan sebagai indikator penanganan pangan secara tidak higinis, termasuk keberadaan patogen tertentu. Mikroorganisme indikator ini sering digunakan sebagai indaktor kualitas mikrobiologi pada pangan dan air.

Tidak semua mikroba yang ada dapat digunakan dalam industri. Menurut Kusnadi (2003) mikroorganisme industri merupakan organisme yang dipilih secara hati-hati sehingga dapat membuat satu atau banyak produk khusus. Bahkan jika mikroorganisme industri merupakan salah satu yang sudah diisolasi dengan teknik tradisional, mikroorganisme tersebut menjadi organisme yang sangat termodifikasi sebelum memasuki industri berskala besar. Sebagian besar mikroorganisme industri merupakan spesialis metabolik yang secara spesifik mampu menghasilkan metabolit tertentu dalam jumlah yang sangat besar pula. Untuk mencapai spesialisasi metabolik tinggi tersebut, strain industri diubah secara genetika melalui mutasi dan rekombinasi.

Berbagai proses industri digunakan untuk menghasilkan produk mikrobiologi dan dipisahkan menjadi beberapa kategori berdasarkan kecenderungan penggunaan produk akhir sebagai berikut:

o    Produksi bahan kimia farmasi

Produk yang paling terkenal adalah antibiotika, obat-obatan steroid, insulin, dan interferon yang dihasilkan melalui bakteri hasil rekayasa genetika.

o    Produksi bahan kimia bernilai komersial

Produk yang termasuk dalam kelompok ini adalah pelarut dan enzim serta berbagai senyawa yang digunakan untuk bahan pemula (starting) untuk industri sintesis senyawa lain.

o    Produksi makanan tambahan

Produksi massa ragi, bakteri dan alga dari media murah mengandung garam nitrogen anorganik , cepat saji, dan menyediakan sumber protein dan senyawa lain yang sering digunakan sebagai makanan tambahan untuk manusia dan hewan.

o    Produksi minuman alkohol

Pembuatan beer dan wine dan poduksi minuman alkohol lain yang merupakan proses bioteknologi berskala besar paling tua.

o    Produksi vaksin

Sel mikroorganisme maupun bagiannya atau produknya dihasilkan dalam jumlah besar dan digunakan untuk produksi vaksin.

o    Produksi mikroorganisme untuk digunakan sebagai insektisida (biosida)

Pengendalian hama tanaman dengan menggunakan mikroorganisme yang berperan sebagai insektisida. Khususnya untuk spesies tertentu, misalnya Bacillus (B. Larvae, B. Popilliae, dan B. Thurungiensis). Spesies tersebut menghasilkan protein kristalin yang mematikan larva lepidoptera (ngengat, kupu-kupu, kutu loncat), misalnya ulat kubis, ngengat gipsy, dan sarang ulat.

o    Penggunaanya dalam industri perminyakan dan pertambangan

Sejumlah prosedur mikrobiologi digunakan untuk meningkatkan perolehan kembali logam dari bijih berkadar rendah dan untuk perbaikan perolehan minyak dari sumur-sumur bor.

-          Bidang kesehatan

Salah satu manfaat mikroorganisme dalam bidang kesehatan adalah dalam menghasilkan antibiotika. Bahan antibiotik dibuat dengan bantuan fungi, aktinomiset, dan bakteri lain. Antibiotik ini merupakan obat yang paling manjur untuk memerangi infeksi oleh bakteri. Beberapa mikroba menghasilkan metabolit sekunder, yang sangat bermanfaat sebagai obat untuk mengendalikan berbagai penyakit infeksi. Sejak dulu dikenal jamur Penicillium yang pertama kali ditemukan oleh Alexander fleming (1928), dapat menghasilkan antibiotika penisilin. Sekarang banyak diproduksi berbagai antibiotik dari berbagai jenis mikroba yang sangat berperan penting dalam mengobati berbagai penyakit. Selain untuk antibiotik, dalam bidang kesehatan mikrorganisme juga dapat digunakan sebagai agen pembusuk di dalam saluran pencernaan alami, yang turut membantu mencerna makanan di dalam saluran pencernaan.

-          Bidang lingkungan dan energi

Mikroorganisme ini banyak dimanfaatkan untuk bahan bakar hayati (metanol dan etanol), bioremediasi, dan pertambangan. Selain itu, mikroorganisme yang ada di lingkungan berperan dalam perputaran/siklus materi dan energi terutama dalam siklus biogeokimia dan berperan sebagai pengurai (dekomposer). Mikroorganisme tanah berfungsi merubah senyawa kimia di dalam tanah, terutama pengubahan senyawa organik yang mengandung karbon, nitrogen, sulfu, dan fosfor menjadi senyawa anorganik dan bisa menjadi nutrien bagi tumbuhan. Mikroorganisme pada lingkungan alami juga dapat digunakan sebagai indikator baik buruknya kualitas lingkungan, baik perairan ataupun terestrial.

-          Bidang bioteknologi

Kemajuan bioteknologi, tak terlepas dari peran mikroba.Karena materi genetika mikroba sederhana, sehingga mudah dimanipulasi untuk disisipkan ke gen yang lain. Disamping itu karena materi genetik mikroba dapat berperan sebagai vektor (plasmid) yang dapat memindahkan suatu gen dari kromosom oganisme ke gen organisme lainnya . Misalnya terapi gen pada penderita gangguan liver. Terapi ini dapat dilakukan secara ex-vivo maupun in-vivo.

Dalam terapi gen ex vivo, sel hati (misalnya) dari pasien yang hatinya telah mengalami kerusakan dipindahkan melalui pembedahan dan perawatan. Kemudian melalui terapi gen akan menyalurkannya dengan menggunakan vektor. Sel-sel hati yang dirubah secara genetik kemudian akan ditransplantasikan kembali dalam tubuh pasien tanpa khawatir akan kegagalan dari proses pencangkokan jaringan tersebut karena sel-sel ini pada awalnya berasal dari pasien.

Strategi terapi gen in vivo meliputi pemasukan gen ke dalam jaringan dan organ di dalam tubuh tanpa diikuti oleh pemindahan sel-sel tubuh. Tantangan utama dalam terapi gen in vivo adalah pengiriman gen hanya terjadi pada jaringan yang diharapkan dan tidak terdapat pada jaringan yang lain. Pada terapi ini, virus digunakan sebagai vektor untuk pengiriman gen (Thieman, 2004).

Beberapa hasil perkembangan bioteknologi lain yang penting dan melibatkan mikroba adalah produksi insulin, tanaman transgenik serta antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal (MAbs) merupakan salah satu antibodi murni yang bersifat sangat spesifik dan menjadi peluru ajaib bagi dunia pengobatan.

2.5  Peranan Mikroba untuk Kelautan

Untuk perikanan sendiri seperti Ikan gindara (Lepidocibium Jlavobronneum) merupakan salah satu spesies ikan laut dalam yang banyak digemari oleh masyarakat, selain rasanya yang gurih juga memiliki khasiat untuk dijadikan obat demam berdarah (Prayitno 2007). Di Pelabuhan Ratu, ikan gindara (Lepidocibium Javobronneum) diperoleh dari hasil tangkap pada kedalaman laut 150-250 meter dan ditangkap dengan menggunakan pancing rawai tuna (long line). Dalam keadaan dioperasikan jangkauan kedalaman mata pancing pada pancing rawai tuna dapat mencapai 100-350 m (Subani dan Barus 1989). Dengan demikian ikan gindara termasuk spesies ikan laut dalam. Organisme laut dalam khususnya ikan memiliki struktur komunitas unik, dengan kemampuan adaptasi tinggi terhadap tekanan, suhu, cabaya, dan surnber makanan. Dalam mempertabankan hidupnya organisme laut dalam memanfaatkan proses kemosintesis oleh bakteri. Kemosintesis adalab suatu proses dimana organisme tertentu menggunakan energi yang disimpan dalam ikatan hydrogen sulfida (H2S) untuk berkombinasi dengan karbondioksida, oksigen, dan proton untuk menghasilkan karbohidrat. Bakteri yang melaksanakan fungsi ini disebut chemotrophs dan merupakan produsen utama dalam ekosistem laut dalam. Berbagai macam konsumen tergantung baik secara langsung maupun tidak langsung pada chemotrophs ini (DKP 2004). Selain itu, ditemukan juga bakteri laut dalam yang dapat meningkatkan kekebalan tubuh karena menyimpan senyawa organik yang dapat menggantikan hngsi insulin (Motik et al. 2005).

Potensi bakteri laut dalam sebagai produsen utama pada ekosistem laut dalam karena dapat menyimpan senyawa organik untuk dimanfaatkan dalam peningkatan kekebalan tubuh. Hal ini diduga memiliki hubungan dengan pemanfaatan ikan laut gindara sebagai obat demam berdarah karena dapat meningkatkan kekebalan tubuh, sementara ikan gindara merupakan ikan laut dalam yang beiperan sebagai konsumen pada ekosistem laut dalam.

Dimana telah diteliti aktivitas antibakteri pada karagenan yang dihasilkan oleh alga merah jenis Condrus crispus. Berdasarkan permasalah tersebut , maka dilakukan penelitian aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli dan Bacillus cereus yang diharapkan dapat memberikan informasi dan bukti ilmiah untuk mengembangkan obat baru dari bahan alam bahari.

Minyak mentah dan minyak olahan adalah senyawa kompleks hidrokarbon yang mempunyai ribuan variasi senyawa. Keragaman senyawa minyak menghasilkan keragaman kualitas fisik kimia. Komposisi dan karakteristik minyak telah dideskripsikan secara rinci (Jokuty, et al., 2000). Pengetahuan mengenai karakteristik minyak, dan karakteristik laut, adalah prasyarat untuk dapat memprediksi kelakuan tumpahan minyak di laut dan perlakuan pemulihan pencemaran.

Perubahan fisik saat minyak terekspose ke lingkungan laut akan menentukan proses bioremediasi, yang terutama adalah:

1)      Evaporasi. Proses ini terutama untuk minyak volatile seperti benzene and smaller n-alkanes. Evaporasi menghasilkan luas permukaan minyak dan menguntungkan bagi mikroba untuk menghilangkan senyawa toksik tersebut.

2)      Pelarutan. Proses ini tidak signifikan dari sudut perpindahan massa tetapi penting dalam proses biodegradasi. Mikroba berada dalam air lebih mudah kontak dengan minyak terlarut.  

3)      Dispersi. Formasi emulsi minyak-air memperluas permukaan butir minyak sehingga memudahkan mikroba untuk memproses minyak. Formasi emulsi ini merupakan proses penting dalam penghilangan hidrokarbon oleh bacteria dan fungi (Singer and Finnerty, 1984). Tetapi emulsi minyak-air dengan penambahan dispersan tidak efektif untuk proses biodegradasi minyak, karena adanya tambahan zat organic dispersan.

4)      Emulsifikasi. Emulsifikasi pembentukan chocolate mousse akan mengurangi luas permukaan minyak sehingga menurunkan proses biodegradasi. Butir tar sebagai agregat besar akan menghambat akses mikroba (Leahy and Colwell, 1990).

2.6  Pengertian Sterilisasi

Pada pengerjaan mikrobiologi, diperlukan suatu kondisi yang benar-benar aseptik dimana alat penunjang serta nutrient dan substrat harus benar-benar steril. Hal ini berarti mikroba kontaminan harus dimatikan. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121 ^oC selama 30 menit, yaitu agar spora atau mikroba dapat dimatikan. Spora adalah sel istirahat yang resisitan terhadap panas dan lingkungan yang berfungsi sebagai tunas untuk berkembang biak selanjutnya. Udara tekan yang digunakan juga harus dalam kondisi steril. Substrat yang berisi nutrien tidak peka terhadap suhu, maka sterilisasi media substrat dilakukan pada 138 ^oC selama 5 menit. Pada substrat yang berisi nutrien tetapi peka terhadap suhu, maka sterilisasi media substrat dilakukan dengan penyaringan bertekanan melalui saringan milipore diameter 0,22 µm (Indra, 2008).

Yang dimaksud sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Ketika untuk pertama kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara aseptic, sesungguhnya hal itu telah menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran. Namun, kebanyakan peralatan dan media yang umum dipakai di dalam pekerjaan mikrobiologi akan menjadi rusak bila dibakar. Untungnya tersedia berbagai metode lain yang efektif (Singleton dan Sainsbury, 2006).

Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan suatu oganiseme yang terdapat pada atau dialam suatu benda. Tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, bahan kimia dan penyaringan. Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah, bila tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi kering. Mensterilkan media dalam tabung erlenmeyer diatas uap air secara tertutup sampai mendidih, lalu media dalam tabung erlenmeyer yang sudah dipanaskan masukan ke dalam cawan petri yang sudah diberi pemanas dengan lampu bunsen, cara memasukan media dalam tabung erlenmeyer ke dalam cawan petri yang sudah dipanaskan baik secara miring atau agak dengan jumlah tertentu sesuai dengan keinginan.

              Teknik mensterilkan meja dan peralatan, teknik memindahkan media dari tabung ke tabung dan teknik penggoresan di dalam cawan petri sebaiknya tidak jauh dari api bunsen, ruangan sebaiknya ber AC, tidak ada udara/angin dan tidak boleh berbicara maupun mengeluarkan napas pada saat memindahkan koloni bakteri (Label, Caray.,2008).

            Sterilisasi dalam mikrobiologi menurut Irianto (2002)  membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Sterilisasi dilakukan bertujuan mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan dengan panas (kalor), gas-gas seperti formalsehide, etilenoksida atau betapriolakton oleh bermacam-macam larutan kimia; oleh sinar lembayung ultra atau sinar gama. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi. Sterilisasi dilakukan dalam proses pembiakan bakteri agar didapatkan bakteri atau mikroorganisme yang kita inginkan dan menyingkirkan mikroorganisme yang bukan menjadi pusat perhatian kita.

             Lebih lanjut Irianto (2002) mengemukakan bahwa sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu sterilisasi pemanasan basah, dengan menggunakan uap atau air panas, sterilisasi kering dalam tanur dan pembakaran total (incineration). Pada umumnya sterilisasi peralatan yang digunakan dalam pembiakan mikroorganisme seperti bakteri menggunakan sterilisasi kering yakni melalui jilatan api (flaming). Jilatan api diterapkan terhadap scalpel, jarim, mulut tabung biakan, kaca objek dan kaca penutup, caranya dengan menjilatkan pada api Bunsen. Sterilisasi diperlakukan pada :

1.      Sterilisasi produk pangan dalam kaleng, botol, dan kemasan lain.

2.      Sterilisasi media cair dan nutrien untuk industry bioteknologi misalnya, obat-obatan dan enzim.

3.      Sterilisasi bioreaktor dengan alat pengendali dan pemonitor.

2.7  Teknik Sterilisasi dan Cara Sterilisasi

Menurut Atlas, R.M  (1946) pemilihan metode didasarkan pada sifat dan bahan yang akan disterilisasi. Untuk mensterilisasikan peralatan dan bahan yang digunakan untuk membuat media dapat dilakukan dengan cara :

1.      Sterilisasi dengan sistem pemanasan, yaitu dengan sistem :

a.       Basah, yaitu bahan yang digunakan harus dengan menggunakan uap air pada suhu tinggi, misalnya sterilisasi media dalam autoklap

b.       Kering, yaitu menggunakan dengan panas tinggi, misalnya sterilisasi ose dengan bunsen.

2.       Sterilisasi dengan sistem kimia, yaitu menggunakan bahan kimia tertentu, misalnya membersihkan meja dengan menggunakan alkohol.

3.      Sterilisasi dengan sistem filtrasi, yaitu mensterilkan bahan yang tidak tahan suhu tinggi, misalnya sterilisasi antibiotik dengan menggunakan filtrasi (penyaringan).

Jenis-jenis sterilisasi berdasarkan cara sterilisasi dapat dibedakan atas :

1.      Sterilisasi secara fisik

2.      Sterilisasi secara kimia

3.      Sterilisasi secara mekanik

4.      Sterilisasi secara gas mikroksida

5.      Sterilisasi dengan saringan membrane

Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah, bila tanpa kelembaban maka disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi panas kering. Di pihak lain, sterilisasi kimiawi dapat dilakukan dengan menggunakan gas atau radiasi. Pemilihan metode didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan. Metode sterilisasi yang umum digunakan secara rutin di laboratorium mikrobiologi adalah yang menggunakan panas.

Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf atau sterilisator uap yang mudah diangkat (portable) dengan menggunkan uap air jenuh bertekanan pada suhu 121 ^oC selama 15 menit. Karena titik didih air menjadi 121 ^oC itu disebabkan oleh tekanan 1 atmosfer pada ketinggian permukaan laut, maka daur sterilisasi tersebut seringkali juga dinyatakan sebagai : 1 atm 15 menit. Pada tempat-tempat yang lebih tingginya diperlukan tekanan lebih besar untuk mencapai suhu 121 ^oC. Karena itu daripada menyatakan besarnya tekanan, lebih baik menyatakan bahwa keadaan steril dicapai dengan cara mempertahankan suhu 121 ^oC selama 15 menit (Cappuccino JG, Sherman N. 1983)

Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat ditembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110 ^oC dan 121 ^oC. Bahan-bahan yang biasa disterilkan dengan cara ini antara lain medium biakan yang umum, air suling,peralatan laboratorium, biakan yang akan dibuang, medium tercemar, dan bahan-bahan dari karet.

Ada 4 hal utama yang harus diingat bila melakukan sterilisasi basah :

1.      Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara harus dikosongkan betul-betul dari ruang sterilisator.

2.      Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkenai uap, karena itu tabung dan labu kosonga harus diletakkan dalam posisi tidur agar udara tidak terperangkap di dasarnya.

3.      Bahan-bahan yang berpori atau berbentuk cair harus permeabel terhadap uap.

4.      Suhu sebagaimana yang terukur oleh thermometer harus mencapai 121 ^oC dan dipertahankan stinggi itu 15 menit.

Sterilisasi panas kering dapat diterapkan pada apa saja yang tidak merusak, menyala, hangus, dan menguap pada suhu setinggi itu. Bahan-bahan yang biasa disterilkan dengan cara ini antara lain pecah belah seperti pipet, tabung reaksi, cawan petri dari kaca, botol sampel, juga peralatan seperti jarum suntik, dan bahan-bahan yang tidak tembus uap seperti gliserin, minyak, vaselin, dan bahan-bahan berupa bubuk. Bahan-bahan yang disterilkan harus dilindungi dengan cara membungkus, menyumbat atau menaruhnya dalam suatu wadah tertutup untuk mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari oven (Hastuti, Utami Sri. 2008).

Proses sterilisasi lain yang juga dilakukan pada suhu kamar ialah penyaringan. Dengan cara ini larutan atau suspensi dibebaskan dari semua organisme hidup dengan cara melakukannya lewat saringan dengan ukuran pori yang sedemikian kecilnya sehingga bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan di atasnya, sedangkan filtratnya ditampung di dalam wadah yang steril. Beberapa contoh bahan yang biasa disterilkan dengan cara ini ialah serum, larutan bikarbonat, enzim, toksin bakteri, medium sintetik tertentu, dan antibiotik.

Gambar 1. Desinfeksi meja kerja (Machmud, 2008)

2.8  Pembuatan Media

Media adalah suatu bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba berupa bahan yang terdiri dari campuran zat makanan (nutrient) yang digunakan untuk kebutuhan makluk hidup dalam melakukan aktivitas dan pertumbuhan selama hidupnya (Tjitrosomo. 1982).

Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Berikut ini beberapa media yang sering digunakan secara umum dalam mikrobiologi :  (www.enidchemicals.com)

-          Lactose Broth

            Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform.
Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef, 0,5% pepton,  dan 0,5% laktosa.

-          EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)

                Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, danSalmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli.

          Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air (www.enidchemicals.com).

-          Nutrient Agar

              Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.

             Untuk komposisi nutrien adar adalah eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.

-          Nutrient Broth

              Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut.

a.       Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades.

b.      Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama.

c.       Atur pH sampai 7,0.

d.      Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml.

e.       Sterilisasi dengan autoklaf (www.enidchemicals.com).

-          MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)

               MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung :

1.      Protein dari kasein 10 g/L

2.      Ekstrak daging 8,0 g/L

3.      Ekstrak ragi 4,0 g/L

4.      D (+) glukosa 20 g/L

5.      Magnesium sulfat 0,2 g/L

6.      Agar-agar 14 g/L

7.      dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L

8.      Tween 80 1,0 g/L

9.      Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L

10.  Natrium asetat 5 g/L

11.  Mangan sulfat 0,04 g/L

MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk cair/broth(www.enidchemicals.com).

-          Trypticase Soy Broth (TSB)

                TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen.

                  Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. Dikalium fosfat ditambahkan sebagai buffer untuk mempertahankan pH.

Plate Count Agar (PCA)

                     PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121°C). Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks.

-          APDA

                    Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat.

-          Potato Dextrose Agar (PDA)

                       PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah didestilasi. campur dan panaskan serta aduk. Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Dinginkan hingga suhu 40-45°C dan tuang dalam cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.

-          VRBA (Violet Red Bile Agar)

                  VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa, sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati. Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu, glukosa, neutral red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan hingga 50-60°C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4. Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri. Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar merupakan agen pemadat.

-    PGYA
               Media ini berfungsi untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir. Dengan adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGYA dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroba terutama sel khamir. Untuk membuatnya, semua bahan dicampur dengan ditambah CaCO3 terlebih dahulu sebanyak 0,5 g lalu dilarutkan dengan akuades. Kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer dan disumbat dengan kapas lalu disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit.

Media yang digunakan mikroorganisme untuk hidup adalah berupa; air, karbon atau nitrogen, energi, mineral, asam amino dan vitamin. Bahan untuk media hidup mikroorganisme dapat dikelompokkan menjadi tiga macam, yaitu :

·         Bahan Dasar :

a.      Air digunakan untuk protoplasma sel, wahana masuknya nutrient, untuk sekresi/ ekskresi dan untuk reaksi enzimatik sel sekitar 70 – 80 % . Dalam pembuatan media sebaiknya menggunakan air suling.

b.      Agar-agar (tumbuhan laut) tidak diuraikan jasad renik dan dapat membeku pada suhu 15 – 20 ºC.

c.       Gelatin adalah berupa protein yang dapat diuraikan oleh mikroorganisme yang sifatnya sama dengan agar-agar.

·         Unsur-Unsur Nutrisi :

a.      Sumber karbon yang berasal dari karbohidrat (contoh : amilum dan glukosa) dan dari asam organik (contoh : asam asetat) digunakan mikroorganisme untuk sumber tenaga.

b.      Sumber nitrogen (contoh : pepton dan ekstrak daging).

c.       Sumber garam-garam ( contoh : K, Na, Fe dan Mg).

d.      Vitamin (contoh : vitamin B).

e.       Bahan dari alami (contoh : sari buah, ekstrak sayuran dan susu).

·         Bahan Tambahan (berupa bahan indikator dan antibiotik)
Berdasarkan macam-macam media hidup mikroorganisme dapat dikelompokkan menjadi beberapa komponen, yaitu :

1.      Berdasarkan Fase atau Sifat Fisik Medianya :

a. Media padat yaitu menggunakan bahan mengandung agar sekitar 15 g/l media contoh : NA. Untuk mengamati penampilan morfologi koloni dan mengisolasi biakan murni.

2.      Media setengah padat yaitu menggunakan bahan yang mengandung agar sekitar 0,5 %/l media, digunakan untuk mengamati mortalitas bakteri.

3.      Media cair tidak menggunakan agar (contoh : NB), digunakan untuk pembiakan dalam jumlah besar melalui penelahaan fermentasi.

·         Berdasarkan Komposisi Zat Kimia Medianya :

a.      Media sintesis, yaitu berdasarkan komposisi zat kimia yang diketahui secara pasti.

b.      Media semi-sintesis, yaitu berdasarkan sebagian besar komposisi zat kimia yang diketahui.

c.       Media non sintesis, yaitu berdasarkan komposisi zat kimia dalam media yang tidak diketahui.

·         Berdasarkan Fungsi Medianya :

a.      Media Umum, yaitu media yang digunakan terdiri dari peptone dan ekstrak khamir (yeast ekstrak) berupa media NA (Nutrien Agar), digunakan untuk pertumbuhan banyak jenis mikroba.

b.      Media selektif, yaitu media yang ditambahkan zat tertentu sehingga bersifat selektif untuk merangsang pertumbuhan satu jenis mikroba dan jenis yang lain mati (contoh : bakteri Vibrio sp yang hanya dapat tumbuh pada media TCBSA (Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose).

c.       Media differensial, yaitu media yang mengandung suatu komponen yang dapat menyebabkan mikroba tertentu terjadi perubahan sehinga mikroba tersebut dapat dibedakan dengan yang lainnya, misalnya pertumbuhan koloni bakteri E. coli yang khas pada medium EMBA (Eosin Methylene Blue Agar).

d.      Media uji (assay media), yaitu media dengan komposisi tertentu untuk mengetahui atau menguji adanya zat tertentu.

e.       Media diperkaya, yaitu media yang berisikan komponen komplek (berupa darah dan serum).

              Dalam pembuatan medium sebaiknya digunakan air suling. Air sadah pada umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang mengandung pepton dan ekstrak daging, air dengan kualitas semacam ini dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat.
          Berdasarkan sumber karbon yang digunakan, organisme dibagi menjadi dua kelompok. Organisme yang dapat mensintesis semua komponen selnya dari karbondioksida disebut autotrof. Sedangkan organisme yang memerlukan satu atau lebih senyawa organik sebagai sumber karbonnya disebut heterotrof. Disamping sumber karbon organik, heterotrof juga memerlukan karbondioksida.
Sumber nitrogen bagi organisme autotrofik ialah senyawa organik, sedangkan hiterotrof dapat berupa asam amino atau senyawa-senyawa protein intermediet seperti peptida, proteosa dan pepton. Misalnya, pada kaldu nutrien (nutrient broth) yang banyak dipergunakan untuk menumbuhkan hiterotrof, nitogen diperoleh dari ekstrak daging dan pepton.

        Faktor tumbuh ialah komponen seluler esensial yang tidak dapat disintetis seniri oleh suatu orgenisme dasi sumber dasar karbon dan nitrogen. Komponen sel dimaksud dapat berupa asam-asam amino atau vitamin.
pH medium juga amat penting bagi pertumbuhan organisme; terutama kerja enzim sangat dipengaruhi oleh pH. Sebagian besar bakteri tumbuh paling baik pada pH sekitar 7.

          Konsistensi medium dapat dibuat macam-macam bergantung kepada keperluannya. Medium cair seperti kaldu nutrien atau kaldu glukosa dapat digunaan untuk berbagai keperluan seperti pembiakan organisme dalam jumlah besar, penelahaan fermentasi dan berbagai macam uji. Bila diinginkan medium padat, dapat ditambahkan bahan pemadat ke dalam medium kaldu. Medium padat biasanya digunakan untuk mengamati penampilan atau morfologi koloni dan mengisolasi biakan murni. Sedangkan medium dengan konsistensi pertengahan disebut medium setengah padat, biasanya untuk menguji motilitas bakteri dan mengandung agar-agar dalam jumlah kecil.

          Yang paling umum digunakan untuk bahan pemadat medium adalah agar-agar, yang larut atau cair pada 100˚C, dan tetap berbentuk cair bila didinginkan sampai kurang 43˚C.

Media buatan manusia dapat berupa :

1.      Medium cair yang biasa dipakai ialah kaldu daging lembu sebanyak 3 gr dalam 1 liter air murni dan 5 g peptone. Peptone ialah protein yang terdapat pada daging, air susu, kedelai, putih telur. Peptone N2 kaldu berisi garam-garam mineral.

2.      Medium kental (padat) biasanya menggunakan kentang yang di potong serupa silinder untuk medium. Ada juga medium dari kaldu yang dicampur dengan sedikit agar-agar. Agar-agar ialah sekedar zat pengental dan bukan zat makanan bagi bakteri.

3.      Medium yang diperkaya. Bakteri juga tumbuh pada dasar makanan. Seperti, bakteri pathogen. Brucella abortus, mycobacterium tuberculosis, diplococcus pneumoniae, memerlukan zat makanan tambahan berupa serum atau darah yang tidak mengandung fibrinogen. Fibrinogen adalah zat yang menyebabkan darah menjadi kental apabila keluar dari luka.

4.      Medium yang kering dapat tersedia dalam bentuk serbuk kering

5.      Medium yang sintetik berupa ramuan-ramuan zat anorganik yang tertentu yang mengandung zat karbon dan nitrogen. bakteri autotrof dapat hidup pada medium ini.

Medium sintetik berguna sebagai medium dasar dalam penyelidikan macam-macam vitamin, asam amino dan lain. Dan juga untuk membedakan Aerobacter aerogenes dari escheria coli. Media yang hanya cocok untuk species-species tertentu dan tidak cocok untuk species yang lain disebut medium selektif.

Dalam pembuatan media dapat digunakan 3 buah larutan peptone dengan pH 7,9 yang berfungsi untuk membantu pembiakan media. Larutan PCA (Potato Clostirel agar) dengan menggunakan media bakteri dan larutan PDA (Potato Dextrose Agar) dengan menggunakan tempe (kapang) dan tomat (Khamir). Pembuatan media ini harus dipersiapkan selama 2-3 minggu

Pada pembuatan media untuk berbagai macam organisme harus menggunakan bahan yang mengandung banyak protein dangan berbagai konsentrasinya sehingga dapat menumbuhkan bakteri (Stanier, 2001).

Komponen anorganik maupun organic merupakan substrat ataupun medium yang baik bagi kehidupan mikroorganisme. Mikroorganisme penghuni tanah merupakan campuran populasi dari protozoa (amoeba, flagllata, cilliata), bakteri (clostridium, rhizobium), alga (ganggang) seperti alga biru, hijau dan jamur terutama jamur bertingkat rendah seperti jamur lender, berbagai ragi, dan berbagai phyromycetes dan ascomycetes (Dwijoseputro, 1998).

           

2.9  Pengecatan (Pewarnaan)

Pewarnaan yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi jika mengenai bagian tubuhnya, karena pewarna tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif atau negatif. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarna yang bermuatan positif misalnya metilen biru, maka akan hasil pewarnaan akan nampak jelas. Secara kimia, zat warna dapat digolongkan ke dalam senyawa asam dan senyawa basa. Jika warna terletak pada muatan positif, maka senyawa tersebut dinamakan zat warna basa. Sebaliknya jika warna terdapat pada ion bermuatan negatif, maka senyawa tersebut dinamakan zat warna asam (Suriawiria, 1986).

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan “acid-fast”(tahan asam) untuk genus Mycobacterium.

Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008).

2.10  Teknik Pengecatan Pada Mikroba

2.10.1    Pewarnaan sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif) (Tryana, 2008).

Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

Gambar 2. Pewarnaan Sederhana

2.10.2       Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam

-          Pewarnaan differensial

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut : (Buckle, 2007)

-          Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Menurut Filzahazny (2008) ada beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dilihat pada table berikut ini :

-          Pewarnaan Tahan Asam

Gambar 3

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).

Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen

-          Pewarnaan Spora

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.

           Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan  Basil Tahan Asam dimana cat  carbol   fuschsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam mycolic  dari Mycobacterium .

Gambar 4

-          Pewarnaan flagel

             Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

-          Pewarnaan kapsul

              Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

2.10.3     Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :

• pewarnaan Neisser (granula volutin),

• pewarnaan yodium (granula glikogen).

2.10.4     Pewarnaan negatif

            Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta.

Cara pewarnaan negatif

- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.

                 Gambar 5 Pewarnaan Negatif  (Hadiotomo, 1990)

BAB III

MATERI DAN METODE

3.1  Waktu dan Pelaksanaan Praktikum

Hari                             : Rabu

Tanggal                       : 23 November 2011

Jam                              : 17.00 – 19.00 WIB

Tempat                        : Gedung E Lantai 2 Laboratorim Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Ilmu Kelautan Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan Universitas Diponegoro Semarang

3.2  Alat dan Bahan

-          Acara 3

Nama Alat dan Bahan	Kegunaan
Autoklaf	untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (1210C, 15 lbs) selama kurang lebih 15 menit.(http://id.wikipedia.org/wiki/Autoklaf).
Bunsen	Untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar bunsen. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas).
Membran Filter	Sebagai penyaring.
Oven	merupakan alat sterilisasi dengan menggunakan udara panas kering, dimana oven berfungsi mensterilisasi alat-alat gelas yang tidak bersekala. Perinsip dari oven ini sendiri adalah menghancurkan lisis mikroba menggunakan udara panas kering(Hadioetomo, Ratna Siri, 1993, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Gramedia diambil dari web).
Disinfektan	Untuk mensterilkan meja kerja dari mikroba dari udara(tim asisten).

-          Acara 4

Nama Alat dan Bahan	Kegunaan
Pepton	produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
Yeast	terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex).
Bacto Agar	untuk pemadat media.
Aged Seawater	sebagai pelarut.
pH	Sebagai acuan kemampuan hidup mikroba.

-          Acara 5

Nama Alat dan Bahan	Kegunaan
Gelas benda	Sebagai tempat untuk biakan.
lampu spirtus	Sama seperti bunsen.Agar tetap steril wilayah kerja kita.
mikroskop	Untuk menngamati bentuk mikroba.
Akuades steril	Untuk mencuci mikroba.
Biakan murni Vibrio.sp, biakan murni Bacillus.sp, dan Biakan Murni E.Coli	Untuk diamati.
Kristal Violet	Sebagai pewarna dalam pewarnaan gram gram.
larutan Ziehl-neelsen	Sebagai pewarna dalam pewarnaan Ziehl-Nelsen.
Alkohol Acid	Sama seperti disinfektan.
Carbol fuschsin Malachite Green Aqueous Safranin	Sebagai cat dalam Pewarnaan Ziehl Nelsen. Sebagai pewarna dalam pewarnaan spora. Sebagai cat pewarna dalam pewarnaan endospore dan gram.

3.3.Cara Kerja

-          Sterilisasi (Acara 3)

1.      Destroyed (Pemanasan)

a.       Alat-alat yang digunakan sebelumnya dalam pembuatan media disterilisasi terlebih dahulu.

b.      Panaskan air pada kompor, cawan petri ataupun tabung reaksi dimasukan perlahan-lahan. Dan semua bagian pada cawan petri dan tabung reaksi harus terendam semua.

c.       Setelah itu, barulah di cuci dengan sabun.

d.      Dan dikeringkan dan dibungkus dengan kertas. Tetapi sebelum dibungkus harus disemprotkan dengan alcohol 75 %.

e.       Lalu masukan dalam autoklaf(apabila ingin menggunakan sistem lahan basah).

f.       Set waktu yakni dengan waktu 20 menit untuk sterilisasi alat, dan 15 menit untuk media.

g.      Setelah selesai, tunggu hingga temperature menunjukan 0 ˚ C (sekitar 5 menit).

h.      Keluarkan alat ataupun media yang sudah disterlisasi.

i.        Alat atau media pun siap untuk digunakan.

1.    Bunsen

 

Gambar 6

a.      Prinsip kerja bunsen

Bunsen merupakan salah satu alat sterilisasi yang menggunakan nyala api. Nyala api berfungsi untuk mensterilkan setiap alat yang digunakan dalam teknik sterilisasi.

b.      Prosedur kerja Bunsen

1.    Nyalakan pembakar bunsen dengan cara membuka tutupnya.

2.    Sterilkan jarum ose dengan membakar ujung jarum yang terbuat dari logam pada api bunsen.

3.    Peganglah jarum dengan posisi agak tegak di atas api (± 45°), bakar jarum hingga berpijar dan pijaran tersebut merambat hingga pangkal bagian logam jarum.

4.    Bila sudah selesai, tunggu beberapa detik hingga suhu ose kembali normal. Atau sentuhkan ujung ose pada permukaan media hingga terdengar bunyi ”ches”.

2.    Inkubator

Gambar 7

a.    Prinsip kerja Inkubator

Inkubator secara umum digunakan sebagai perlengkapan dalam laboratorium mikrobiologi pangan. Inkubator memiliki fungsi yang sama dengan water bath yaitu sebagai alat inkubasi pada analisa mikrobiologi. Inkubator adalah alat yang digunakan untuk menciptakan suhu stabil dan konstan. Suhu inkbator dipengaruhi oleh adanya perubahan suhu pada suhu ruang, oleh karena itu perubahan suhu ruang perlu diawasi terutama saat terjadi perubahan musim.

b.   Prosedur Sterilisasi Panas Kering pada inkubator

1.    Buka tutup inkubator dan masukkan peralatan dari gelas yang sudah dibungkus ke dalam inkubator.

2.    Tutup inkubator dan atur pengontrol suhu pada angka 160-180°C selama 1-2 jam.

-          Pembuatan Media( Acara 4)

1.    Cara Sterilisasi Gelas ukur dan Tabung Reaksi

a)               Kapas di bungkus kain kasa dan di ikat dengan benang kasur.

b)               Bungkusan kapas di masukkan ke mulut tabung reaksi dan labu ukur kemudian permukaannya di tutup dengan alumunium foil dan di ikat menggunakan benang kasur agar tidak terlepas selanjutnya tabung reaksi dan labu ukur di masukkan ke dalam autoclave.

2.    Cara sterilisasi gelas kimia

a.    Permukaan gelas kimia dan labu ukur di tutup dengan aluminium foil.

b.   Gelas kimia dan labu ukur di masukkan ke dalam autoclave.

3.    Cara sterilisasi cawan petri:

a.    Seluruh permukaan cawan petri di bungkus menggunakan kertas hvs.

b.   cawan petri yang telah dibungkus di masukkan ke dalam autoclave.

4.    Cara sterilisasi pada media pengencer larutan

a.    Nutrient agar di timbang dengan timbangan analitik untuk pembuatan larutan tertentu.

b.   Nutrien agar dimasukkan kedalam labu erlenmeyer dan ditambahkan aquades.

c.    Lalu dipanaskan mengunakan kompor/oven dan diaduk menggunakan batang pengaduk.

d.   Larutan dibagi menjadi 2 bagian kedalam labu erlenmeyer dan mulut labu.

e.    Erlenmeyer ditutup dengan gulungan kapas.

f.    Kemudian dilapisi dengan alumunium foil.

g.   Masukkan kedalam autoclave.

-          Pewarnaan (Acara 5)

1.      Pembuatan Preparat Bakteri

Bakteri diratakan setipis mungkin diatas gelas benda yang bersih. Selanjutnya bakteri difiksasi dengan cara melakukan secara cepat diatas nyala api Bunsen kira-kira 2-3 kali. Smear sekarang siap untuk diwarnai.

2.      Pewarnaan Gram

a.       Bubuhkan Kristal violet sampai smear terendam cat, biarkan selama 1 menit, kemudian cuci dengan air mengalir.

b.      Bubuhkan smear dengan Burke, s iodine selama 1 menit, cuci dengan air mengalir.

c.       Deklonisasi dengan etanol 95 %, cuci dengan air mengalir.

d.      Bubuhkan cat penutup dengan safranin akuosa, diamkan selama 30 detik, cuci dengan air mengalir.

e.       Keringkan anginkan preparat.

f.       Amati dibawah mikroskop dengan minyak imersi.

3.      Pewarnaan Endospora

a.       Bubuhkan cat malachite green pada smear, panaskan sampai cat menguap. Hindari preparat mendidih. Cuci dengan air mengalir.

b.      Bubuhkan cat penutup dengan aqueous safranin, diamkan selama 1-2 menit. Cuci dengan air mengalir.

c.       Kering anginkan.

d.      Amati dibawah mikroskop dengan minyak imersi.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1  Hasil

-          Sterilisasi

Sterilisasi                 Destruction                Dipanaskan             Cuci dengan sabun             Lalu dikeringkan

             Autoklaf merupakan alat untuk sterilisasi dengan menggunakan sistem basah.  Khusus untuk cawn petri dibungkus dengan memakai kertas biasa. Cara melipat pun ada cara khusus. Sebelum dibungkus, semprot dahulu dengan alcohol lalu di lap.

               Lubang pada autoklaf  adalah untuk pengeluaran gas (uap). Terdapat 3 besi pada dasar autoklaf  dan apabila ingin melakukan sterilisasi direndam dengan air hingga 3 besi tersebut terendam.

            Sterilisasi dengan autoklaf dilakukan pada suhu 121˚ C , dengan 1 atmoser, dan 15 psi. Tutup pada autoklaf haruslah ditutup sekencang-kencangnya, ini dikarenakan apabila tidak ditutup dengan kencang tutup akan keluar karena sebagaimana kita ketahui di dalam autoklaf terdapat kekuatan tekanan sebesar 1 atmosfer. Katup pada autoklaf dibagian luar terdapat 2, diantaranya adalah berfungsi untuk pengamanan. Sedangkan 1 lagi, yakni katup utama berperan untuk imbangi keluar atau masuknya udara.

Adapun contoh untuk sterilisasi alat pada autoklaf dimana sebagai berikut,

Alat              20 menit                Matikan lampu           Tunggu hingga temperature menunjukan angka 0˚C          baru dibuka dan diambil alat yang telah disterilisasi.  

                Alat sterilisasi lainnya adalah incubator, disini menggunakan sistem lahan kering, dengan menggunakan temperature sebesar 171 ˚C. selain incubator, terdapat alat lain, yaitu Bunsen, dimana Bunsen harus selalu dinyalahkan saat proses kerja (semuanya harus dekat dengan Bunsen). Di laboratorium pun selain alat yang harus steril keadaan praktikan pun harus steril dengan menyemprotkan alcohol 75 % ke tangan ataupun ke alat.

              Adapun untuk alat sistem kering ada 2, yaitu incubator dan oven. Tetapi kedua alat tersebut berbeda dimana oven memiliki kekurangan. Diantaranya pada oven temperature akan naik terus, lalu ruang pada oven tidak sebanyak incubator, dan terakhir adalah settingan(Pengaturan) waktu pada oven akan lebih sedikit dibandingkan dengan incubator.

               Alat lainnya adalah membrane filter, dimana terdapat 2 komponen alat yang berbeda. Membrane dan filter sehingga apabila disatukan menjadi membrane filter.

-          Pembuatan media

            Yeast sama pepton merupakan nutrisi untuk bakteri pada pembuatan media. Berikut komposisi pada pembuatan media menggunakan media marine bacteria dengan medium zobel :

-          Pepton                                   : 0.25 gr

-          Yeast                                     : 0.05 gr

-          Bacto alga                              : 1.5 gr

-          Aged Seawater                      : 100 ml

*( 100 ml merupakan patokan dalam pembuatan media)

Zobel, dengan komposisi :

a.       Pepton sebagai nutrient untuk bekteri.

b.      Bacto agar sebagai perekat pada zobell padat.

c.       Ekstrak Yeast sebagai nutrient untuk bakteri.

d.      Pada zobell cair tidak memerlukan bacto agar.

Cara pembuatan :

1.      Setelah di timbang masukkan ke dalam Erlenmeyer. Dan biasanya digunakan air laut yang steril.

2.      Dipanaskan sambil diaduk, dipanaskan sampai terlihat buih-buih sampai mendidih.

3.      Ditutupi pakai kapas yang padat.

4.      Dipakai alumunium foil.

5.      Media yang menggunakan cawan petri disebut media miring, sedangkan media cawan petri disebut media datar.

*Jangan dalam keadaan panas saat memindahkannya agar tidak menguap, air dari uap tersebut akan menghasilkan jamur dan akan terjadi kontaminasi.

-          Pengecatan (Pewarnaan)

1.      Pengecatan Gram

Menggunakan bahan-bahan yaitu :

a.       Kristal violet

b.      Burke,s iodine

c.       Ethanol 95%

d.      Safranin akuosa

Keterangan hasil :

·         Bakteri gram positif berwarna violet.

·         Bakteri gram negative berwarna merah.

·         Beberapa bakteri bersifat gram variabel, bakteri ini tidak pernah tampak berwarna semuanya merah atau violet.

·         Bakteri gram positif dapat berubah menjadi gram negative diantaranya karena pengaruh umur dan kondisi pertumbuhan.

2.      Pengecatan Spora

Menggunakan bahan-bahan yaitu :

a.       Malachite green

b.      Safranin akuosa

Keterangan hasil :

·         Spora tampak berwarna hijau. Sel dan bagian sel yang lain berwarna merah.

4.2  Pembahasan

-          Sterilisasi

Menurut Koesmadji (2002) prinsip sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

1.      Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22mikron atau 0.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik.

2.      Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.

-          Pemanasan

a.        Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b.      Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180˚C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c.       Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

d.      Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf

-           Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV

3.      Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.

Prinsip cara kerja autoklaf

Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat, autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 121˚C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 121˚C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 121˚C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121˚C dan tekanan 15 psi selama 15 menit. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam

autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. (Koesmadji, 2002).

Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :

-          Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim

-          Pelarut organik, seperti fenol

-          Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS

Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :

-           Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat

-          Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain.

-          Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar

-          Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf

-          Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0

Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya, sisa

ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada Erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yang

mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini

.

Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization)

Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas.

·         Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil

·         Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam.

Inkubator

Inkubator digunakan untuk sterilisasi kering pada suhu 171⁰C. Alat ini untuk mengeringkan alkhol yang tersisa di cawan petri atau alat lainnya agar tidak membekas atau bercak. Perbedaan inkubator dengan oven adalah pada inkubator dilengkapi pengatur suhu, sedangkan pada oven tidak terdapat pengatur suhu. Sehingga apabila inkubator dibuka, suhu tersebut akan berangsung-angsur menurun sesuai dengan suhu lingkungan, sedangkan pada oven tidak.

Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)

Bunsen merupakan alat pemanasan sederhana yang menggunakan spiritus. Bunsen digunakan untuk mensterilisasi setiap alat pada saat melakukan praktikum mikrobiologi khususnya pembuatan media. Hal tersebut bertujuan agar alat tetap steril dan tidak terkontaminasi oleh bakteri. Sehingga dierlukan api bunsen yang berada didekat kita apabila melakukan kegiatan yang bersifat mikrobiologi.

Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol.

Alkohol 75% digunakan dengan cara menyemprotkan disekitar area tempat kita melakukan praktikum mikrobiologi. Fungsi dari alkohol 75% ini untuk mensterilkan area laboratorium dari kontaminasi bakteri-bakteri. Menggunakan konsentrasi 75% karena dengan konsentrasi tersebut bakteri yang berada disekitar kita dapat langsung mati.

-          Pembuatan Media

Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media : (Weesley, V. 1993)

a.       Agar, dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam.

b.      Peptone, adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.

c.       Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex).

d.      Karbohidrat, Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.

Dalam pembuatan media, larutan yang telah ditimbang kemudian dicampur dalam erlenmeyer. Kemudian dilakukan pemanasan dengan tetap mengaduk larutan tersebut. Hal tersebut bertujuan agar larutan tersebut bercampur hingga homogen, agar tidak ada larutan yang menggumpal. Setelah dipanaskan, ditunggu hingga larutan hangat. Hal tersebut dilakukan karena apabila larutan masih panas dituangkan pada cawan petri atau tabung reaksi, akan mengakibatkan uap air sehingga lembab menimbulkan jamur pada media tersebut.

Cara menuangkan larutan media pada cawan petri atau tabung reaksi dengan cara mendekatkan pada api bunsen agar media tidak terkontaminasi. Selain itu, cawan atau tabung reaksi harus berada di tempat yang datar. Cara meratakan pada cawan petri dengan digoyangkan secara perlahan agar tidak ada bagian yang kosong. Karena pada bagian yang kosong tersebut merupakan zona hambat yang akan diukur dengan jangka sorong. Cara meratakan media pada media miring (tabung reaksi) adalah dengan memiringkan tabung reaksi agar lebih mudah untuk meratakannya dan menyebar rata. Sedangkan pada media datar cukup ditaruh pada daerah yang datar kemudian diratakan dengan L glass (Rusdimin, 2003).

Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)

Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alas an efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.

Gambar 8

Pada penanaman bakteri, hasil yang didapatkan akan berbeda antara teknik spread dan pour plate, pada teknik spread karena yang diletakkan terlebih dahulu adalah media baru kemudian bakteri, maka bakteri hanya akan hidup pada permukaan medianya saja karena bakteri tidak dapat masuk kedalam media.

Sedangkan peda teknik pour plate, karena yang dimasukkan terlebih dahulu adalah bakteri baru kemudian media dan kemudian digoyang-goyang membentuk angka 8, maka bakteri dapat hidup dibawah dan didalam media.Hal ini berakibat berbedanya cara pengambilan sample bakteri, pada teknik spread, bakteri cukup dengan digores saja karena berada pada bagian atas media. Sedangkan hasil dari pour plate harus dicungkil untuk mendapatkan hasil atau sampel bakterinya.

Dalam penelitian ini, media yang digunakan untuk isolasi, kultur, penyimpanan isolat murni dan uji sensitivitas adalah Zobell 2216E (half strength dan full strength). Untuk Zobell half  strength bahan-bahan yang dibutuhkan adalah Pepton, Yeast serta Agar, sesuai dengan takaran yang telah ditentukan dan dibutuhkan, sedangkan  untuk Zobell full komposisi Pepton dan Yeast-nya 2 kali lipat dari komposisi awal.  Kemudian dicampurkan dalam air laut steril lalu dipanaskan dan diaduk sampai homogen. Dalam hal ini, ada 2 jenis Zobell yang digunakan pula yaitu Zobell padat dan Zobell cair, perbedaan kedua Zobell hanya terletak pada komposisi racikannya yaitu untuk zobell cair tidak menggunakan agar(http://onypoenya.files.com/2011/03/laporan-praktikum-mikrobiologi-umum-pewarnaan-sel-bakteri-dan-jamur-dan-pewarnaan-endospora.doc).

Cawan Petri (Petri Dish)

Gambar 9

Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml(Framesti.2010).

Dari 2 alat untuk pertumbuhan bakteri tersebut terdapat perbedaan dalam prosesnya dimana, pada cawan petri media cair yang ada di Erlenmeyer sebelum dimasukan ke cawan petri harus dimasukkan terlebih dahulu ke autoclave. Sedangkan pada tabung reaksi larutan yang sudah homogen pada Erlenmeyer  dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dan tabung reaksi yang nantinya disterilisasi di autoclave.

-          Pewarnaan

Pewarnaan Endospora

Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya(Waluyo (2004). Langkah-langkahnya sebagai berikut:

a)      Gunakan teknik aseptis, siapkan biakan bakteri dalam kondisi udara yang kering dan dengan pemanasan yang baik.

b)      Siapkan waterbath yang dipanaskan.

c)      Tutup gelas preparat dengan selembar tisu dan letakkan pada rak di atas waterbath.

d)     Tetesi dengan malachite green.

e)      Panaskan gelas preparat selama 5 menit.

f)       pindahkan gelas preparat dari waterbath dan ambil kertas tisu dari preparat.

g)      Biarkan gelas preparat dingin lalu cuci dengan air deionisasi.

h)      Keringkan dan tambahkan safranin, diamkan selama 2 menit.

i)        Cuci sisa safranin dengan air deionisasi dan keringkan noda.

j)        Lakukan pengamatan preparat dengan mikroskop dengan bantuan minyak emersi.

Respon  Bakteri Penghasil Spora dan Yang Tidak Tahan Pengecatan

   

                                                       Gambar 10
      Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Oleh karena itu, setelah diwarnai oleh suatu warna, misalnya malachite green, akan mengikat kuat senyawa pewarna. Untuk pewarnaan selanjutnya, cat tersebut (misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama. Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau

         Bakteri yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai oleh malachite, sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin (Fardiaz, 1992).

               Contoh yang paling mudah adalah untuk spesies Bacilllus subtilis dan E. Coli. B. Subtilis akan berwarna hijau setelah pengecatan. Hal ini berarti B. Subtilis memiliki endospora. Endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan linghkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari safranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian.

            Eschericia coli setelah pengecatan akan berwarna merah muda dari safranin. E.coli berarti tidak memiliki endospora, hanya memiliki sel vegetatif. Karena E.coli hanya memiliki sel vegetatif, sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan. Saat diwarnai denga malachite, sel vegetatif tidak dapat mengikat malachite sehingga saat dilunturkan, warna malachite dapat hilang. Kemudian saat diberi safranin, sel vegetatif dapat mengikat warna kembali sehingga warna sel menjadi merah muda (Prescott, dkk, 2002).

Pewarnaan Gram

  Pewarnaan gram merupakan prosedur yang paling bermanfaat dalam Mikrobiologi diagnostik. Ketika dicurigai adanya infeksi bakteri, sebagian besar bahan yang diserahkan harus diapus pada glas objek dan diwarnai gramkemudian diperiksa secara mikroskopik. Pada pemeriksaan mikroskopik reaksi gram dan morfologi bakteri harus diperhatikan . Terlihatnya bakteri pada apusan pewarnaan gram tidak berarti dapat melakukan identifikasi sampai spesies. Beberapa bakteri gram positif tak hidup dapat terpulas secara gram negatif. Biasanya, morpologi bakteri ditetapkan dengan menggunakan organisme yang ditumbuhkan pada agar. Namun, bakteri dalam cairan atau jaringan tubuh dapat mempunyai morpologi yang sangat beragam.
Dinding sel yang tebal pada gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi menyebabkan pori-pori dinding sel menutup, sehingga mencegah larutnya kompleks ungu kristal yodium pada langkah pemucatan, sedangkan sel-sel gram negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol aceton. Larutnya lipid oleh pemucat yang digunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah yang menyebabkan proses pemucatan berlangsung lebih cepat(Lay, Bibiana W,1994).

Menurut Schmidt K, (1985) dalam Baskoro T, (1994) bahwa suatu koloni dengan gram negative termasuk kedalam bakteri aerob dan anaerob, dan diantaranya ada beberapa yang dapat menyebabkan penyakit infeksi selaput lendir dan saluran cerna mamalia.

Faktor-faktor lain yang juga menimbulkan keragaman dalam reaksi gram:

-          Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan

-          Kerapatan sel pada olesan.

-          Konsentrasi dan umur-umur reagen yang digunakan untuk pewarnaan gram

-          Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucat yang digunakan.

-          Sejarah biakan.

Gambar Bakteri Gram Positif Batang

Gambar Bakteri Gram Positif Coccus

   

  contoh bakteri gram negatif

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1.      Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2.      Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3.      Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4.      Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membrane sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:( Adam,M. 2000)

No.	Perbedaan	Bakteri Gram Positif (+)	Bakteri Gram Negarif  (-)
1	Dinding sel	Lapian peptidoglikan tebal	Lapian peptidoglikan lebih tipis
2	Kadar lipid	1-4% (Lebih rendah)	11-22% (Lebih tinggi)
3	Resistensi terhadap alkali (1%KOH)	Lebih pekat	Larut
4	Kepekaan terhadap Yodium	Lebih peka	Kurang peka
5	Toksin yang dibentuk	Eksotoksin	Endotoksin
6	Resistensi terhadap tellurit	Lebih tahan	Lebih peka
7	Sifat tahan asam	Ada yang tahan asam	Tidak ada yang tahan asam
8	Kepekaan terhadap penisilin	Lebih peka	Kurang peka
9	Kepekaan terhadap streptomisin	Tidak peka	Peka
10	Penghambatan warna	Lebih dihambat	Kurang dihambat
11	Ketahanan terhadap fisik	Lebih tahan	Kurang tahan
12	Kebutuhan nutrien	Kompleks	Relatif

BAB V

PENUTUP

5.1  Kesimpulan

Kesimpulan adalah menjawab daripada tujuan dari praktikum, dimana tujuan praktikum adalah :

-          Praktikan memahami bermacam-macam teknik sterilisasi.

-          Praktikan dapat mengoperasikan alat-alat sterilisasi.

-          Praktikan memahami mengenai bermacam-macam media.

-          Praktikan dapat membuat media.

-          Praktikan memahami bermacam-macam teknik pewarnaan.

-          Praktikan dapat melakukan gram, acid fast, pewarnaan endospore, dan  pewarnaan flagella.

Sehingga dapat disimpulkan dari praktikum :

1.       Teknik sterilisasi dibedakan menjadi dua, yaitu sterilisasi basah yang menggunakan Autoklaf dan sterilisasi kering yang menggunakan Inkubator. Selain itu bunsen digunakan untuk sterilisasi alat, alkohol 75% digunakan untuk sterilisasi ruangan laboratorium.

2.       Alat – alat sterilisasi :

a.       Autoklaf, sterilisasi basah dengan cara merebus alat didalam dandang autoklaf selama 20 menit untuk alat dan 15 menit untuk media pada suhu 121⁰C.

b.      Bunsen, sterilisasi alat yang harus didekatkan pada saat melakukan praktikum mikrobiologi khusunya pembuatan media bakteri

c.       Inkubator, sterilisasi kering yang dioperasikan dengan cara memasukkan alat ke dalamnya yang sebelumnya telah dibungkus dengan kertas pada suhu 171⁰C.

d.      Alkohol 75%, digunakan untuk sterilisasi ruangan dengan cara menyemprotkan alkohol 75% ke sekitar praktikan untuk menghindari kontaminasi bakteri.

3.       Media yang diketahui ada 4 yaitu media marine bakteri, media marine fungi, media marine yeast dan media marine actinomycetes. Media marine backteri dibagi lagi menjadi Zobell,s 2216 e medium, Modified Zobell,s 2216 e medium, dan Median untuk isolasi bakteri ekstrim halofilik.

4.       Media yang dibuat dengan menggunakan 100 ml air sebagai patokan dalam menimbang bahan-bahan yang digunakan untuk membuat media bakteri. Dan sangat di haruskan dalam pembuatan media keadaan sekitar maupun alat harus steril. Dan dalam pembuatan media terdapat perbedaan komposisi bahan yang akan digunakan.

5.       Teknik pewarnaan dengan menggunakan bahan-bahan kimia yang mampu memberi cat warna pada smear. Teknik pewarnaan ada gram, Ziehl-Neelsen untuk bakteri acid fast, spora dan flagella.

6.       Pada pewarnaan gram, bahan yang digunakan untuk cat pewarna yaitu kristal violet, burke,s iodine, ethanol 95% dan safranin akuosa. Pada pewarnaan spora , bahan yang digunakan untuk yaitu melachite green dan safranin akuosa.

5.2  Saran

-          Praktikan dalam praktikum harus lebih aktif baik bertanya maupun menjawab pertanyaan.

-          Prasarana dan sarana laboratorium diharapkan untuk dilengkapi, agar praktikum dapat berjalan dengan lancar. Disayangkan apabila praktikum hanya dijelaskan tanpa ada praktikum langsung. Sehingga praktikan hanya mengerti teori tetapi untuk secara praktikum langsung tidak bingung.

-          Praktikan harus belajar sebelum pre test.

DAFTAR PUSTAKA

Jutono, 1972. Dasar – Dasar Mikrobiologi . Departemen Mikrobiologi : UGM

Hadioetomo, Ratna Siri., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT. Gramedia : Jakarta

Lim,D. 1998. Microbiology, 2nd Edition. McGrow-hill book          : New york.

Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga       : Jakarta

Tryana, S.T. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang

Rizky.2008.http://ngecat bakteri makulrizki.blogspot.com/2008/02/materi kuliah html. (Diakses tanggal 24 November 2011, Pukul 16.00 WIB)

Tortora, Funke, Case. 2010. Microbiology an introduction tenth edition. Pearson Benjamin Cummings : USA

Kathleen, Park Talaro. 2009 . Foundations in Microbiology seventh edition, McGraw-Hill : USA

Michael, J. 1988. Dasar-dasar Mikrobilogi. Badan Penerbit Universitas Indonesia Press: Jakarta.

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga : Jakarta.

Robinson, R. K. 1990. Dairy Microbiology, volume 2 the microbiology of milk Product : London.

Jaweta, E. 1986. Mikrobiologi Untuk Profesi Kesehatan. EGC : Jakarta.

Lay, Bibiana W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium, PT RajaGrafindo Persada : Jakarta.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia : Jakarta

Pelczar, M. J. & E. C. S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press : Jakarta.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti : Jakarta.

Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press : Malang.

Rachdie. 2006. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba. http://rachdie .blogsome.com/2006/10/14/faktor-yang-mempengaruhi-pertumbuhan-mikroba/. Diakses pada tanggal 24 November 2011, Pukul 16.00WIB)

Kusnadi. 2003. Mikrobiologi. JICA-IMSTEP.

Darkuni, Noviar. 2001. Mikrobiologi. JICA : Malang

Schlegel, H. G dan Schmidt, K. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press: Yogyakarta.

Tarigan, Jeneng. 1988. Pengantar Mikrobiologi. Jakarta: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Proyek Pengembangan Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan.

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Imagraph : Jakarta

Thieman, dkk. 2004. Introduction to Biotechnology. Benjamin Cummings : New York

Prayitno BY. 2007. &an Gindara. ht~://www.wikimu.com/News.asvx?=3551

(diakses tanggal 24 November 2011, Pukul 16.00 WIB)

Subani W, Barus HR. 1989. Alat Penangh-apan Ih-an dan Udang di Indonesia.

BPPL           : Jakarta

Anonimous. 2004. Perairan Laut Dalarn. Jakarta: Departemen Perikanan dan

Kelautan.

Motik C, dkk. 2005. Kekayaan Laut Masa Depan Kita. Departemen Kelautan dan Perikanan : Jakarta

Jokuty, P., dkk. 2000. A Catalogue of Crude Oil and Oil Product Properties. Environmental Protection Service, Environment Canada, Ottawa, ON.

Singer M.E. and Finnerty, W.R. 1984. Microbial metabolism of strat-chain and branched alkanes. In Atlas (Ed), Petroleum Microbiology, Macmillan Publishing Company, New York, pp1-60.

Leahy, J.G.; Colwell, R.R. 1990 Microbial Degradation of hydrocarbons in the environment. Microbial Reviews, 53(3), 305-315.

Indra., 2008, http//ekmon-saurus/bab-2-Media- pertumbuhan/.htm( diakses pada tanggal 24 November 2011 pukul 21.20)

Singleton dan Sainsbury, 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd Edition. John Wiley and Sons Inc. Sussex :  England.

Label, Caray.,2008, http//Caray label makalah –dan – skripsi pembuatan-media- agar dan-sterilisasi/htm .diakses pada tanggal 25 November 2011 pukul 21.22 WIB)

Irianto, Koes.2006. Mikrobiologi Jilid 1. Yrama Widya : Bandung

Atlas,R.M.1946.Handbook Of Microbiological Media 3^th Edition.CRC Press: Amerika

Cappuccino JG, Sherman N. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. State University of New York, Rocklagd Community Collage : New York

Hastuti, Utami Sri. 2008. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Universitas Negeri Malang : Malang

Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan : Bogor

Tjitrosomo. 1982. Dunia Mikroba. Bharata Karya : Jakarta

www.enidchemical.com(Diakses tanggal 24 November 2011, Pukul 16.10 WIB)

Stanier Roger. Edward Alderberg dan John Ingraham. 1982. Dunia Mikroba 1. Bharata Karya Aksara : Jakarta.

Dwidjoseputro D. 1998, Dasar-Dasar Mikrobniologi. Djambatan : Malang.

Suriawiria, Unus. 1986. Pengantar Mikrobiologi Umum, Angkasa : Bandung.

Jimmo., 2008,(http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht,. diakses pada tanggal 25 November 2011, Pukul 23.00 WIB)

Gupta S. 1990. Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh Julius ES., edisi 3,

Peberbit Binarupa Aksara.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Pelezar,chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta

Buckle.2007 Mikrobiologi Terapan. Universitas Gajah Mada: Yogyakarta

Fizahazny. 2008. (http// wordpress.com/ Pengantar Temtamg Bakterihtml. Diakses tanggal 25 Nopember 2011, Pukul 23.00 WIB)

Hadioetomo, Ratna S. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek.  PT Gramedia : Jakarta

Koesmadji, 2002. Teknik Laboratorium. Universitas Pendidikan Indonesia Press : Jakarta

Weesley, V. 1993. Mikrobiologi Dasar. Erlangga : Jakarta

Rusdimin.2003. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia : Jakarta

http://onypoenya.files.com/2011/03/laporan-praktikum-mikrobiologi-umum-pewarnaan-sel-bakteri-dan-jamur-dan-pewarnaan-endospora.doc(Diakses tanggal 24 November 2011, Pukul 16. 00 WIB)

Framesti.2010. Dasar-Dasae Mikrobiologi. Jantaran : Jakarta

Prescott, LM; John PH; Donald AK. 2002. Microbiology 5th edition. McGraw-Hill Company : New York

Baskoro ,T . 1994. Mikrobiologi Umum. Gajamada Prews : Jakarta.

Adam,M. 2000. Mikro Biologi Dasar. Erlangga : Jakarta